题目：泛癌分析揭示乳酸代谢在免疫治疗反应预测和生存预测新的见解

英文名：Pan-cancer analysis implicates novel insights of lactate metabolism into immunotherapy response prediction and survival prognostication

杂志：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research

影响因子：11.4

研究背景：免疫疗法已经成为一种有效的临床癌症治疗方法，靶向肿瘤细胞中的乳酸代谢（LM）作为增强抗肿瘤免疫反应的方法是一种有前景的治疗策略。作者利用scRNA-seq数据和多种机器学习（ML）算法，在泛癌水平上揭示了LM和免疫治疗耐药性之间的紧密相关性，并进一步建立了一种新的LM相关特征基因集（LM. SIG），为患者选择合适的免疫治疗提供了参考。

研究思路：

图1

作者首先在两个免疫疗法scRNA-seq数据集中说明并验证了LM与免疫治疗反应之间是存在负相关的。随后，基于40个泛癌scRNA-seq队列建立了LM相关特征基因集（LM.SIG），然后，基于8个免疫治疗转录组队列和30个癌症基因组图谱（TCGA）泛癌数据集，采用15种机器学习（ML）算法来验证LM.SIG在免疫治疗反应预测和生存预测方面的能力。此外，作者还基于17个CRISPR数据集，筛选了免疫治疗潜在的靶点，通过下游实验在胰腺癌类器官中进行了验证。

研究结果：

1、 LM上调与免疫治疗耐药相关

作者对2个免疫治疗的scRNA-seq数据集进行分析，计算LM的相关基因的得分，结果表明，LM水平升高的恶性细胞在无应答（NR）组内表现出富集（图2A），这个结果在另一个数据集得到验证（图2C-D），这些结果共同表明LM与免疫治疗耐药有关。

图2

2、 使用泛癌scRNA-seq队列建立LM. SIG

作者利用泛癌scRNA-seq队列数据，进行GSVA分析，筛选与LM相关基因的基因集：LMx（与LM呈正相关的基因）、LMy（恶性细胞中上调的基因），取交集得到LMn。计算LM1-LM40的单个基因的Spearman相关系数（R）的几何平均值，超过0.25的基因收集到LM SIG中，共有84个基因（图2E）。基于Reactome（图2F）、GO（图2G）和KEGG（图2H）对这84个基因注释，结果表明，LM. SIG主要富含乳酸代谢相关和致瘤途径，如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）相关途径、三羧酸（TCA）循环相关途径和TP53调节，有几个基因被报道与免疫活性相关，如C1QBP、TUFM、LDHA、LDHB和ACAT1。

3、基于泛癌TCGA队列的LM. SIG免疫图谱

在基因层面，作者比较了LM.SIG与不同癌症类型免疫相关基因表达水平之间的相关性，LM.SIG评分与这些基因的表达之间存在显著负相关（图3A）。细胞层面，高LM.SIG评分的肿瘤减少了抗肿瘤免疫细胞的浸润，包括NK细胞和细胞毒性淋巴细胞（图3B）。在通路上，高LM. SIG评分的患者中排名靠前的通路有氧化磷酸化、活性氧途径、DNA修复和MYC靶向通路等（图3C）。因此，获得较低LM.SIG的患者往往比获得较高LM.SIG的患者获得更好的抗肿瘤免疫。

图3

4、LM.SIG的免疫治疗反应预测

将8个临床信息完整的免疫治疗数据集，分类为训练集（n=618）、验证集（n=154）和测试集（n=79）（图4A）。使用7种机器学习算法训练模型，并迭代10次重复5倍交叉验证，计算AUC值，确定best的LM.SIG模型（图4B-C）。随后进行了一系列测试，证明了LM.SIG在预测泛癌数据集中免疫治疗反应的能力。

图4

5、LM.SIG 的生存预测

为了调整LM.SIG对泛癌生存率的预测，作者开发了一种基于SurvBenchmark设计的生存模型。评估了各种生存特异性模型，利用TCGA泛癌患者数据集训练LM.SIG预后模型，MTLR_GA并被确定为best模型（图5A）。

图5

6、使用CRISPR研究从LM. SIG产生的潜在治疗靶点

从7项CRISPR研究中提取17个CRISPR数据集，CRISPR基因中z评分排名靠前的基因被视为免疫抵抗基因（图6A）。LM.SIG占排名靠前的基因的比例高于其他特征（图6B-C）。为了进一步研究具有免疫治疗预测和生存预测的靶点，将19个CRISPR集中的基因和10个LM. SIG预后模型相关的基因取交集，得到靶点基因LDHA（图6D）。LDHA基因的显著性也在TCGA泛癌数据集和3个队列数据集中得到验证（图6E-G）。

图 6

7、LDHA缺乏增强胰腺癌的抗肿瘤免疫和免疫治疗反应

从患者外周血中分离CD8+T细胞和CD14+单核巨噬细胞，体外M-CSF激活并与sh-NC 或 sh-LDHA胰腺癌类器官共培养（图7A）。显微镜观察和细胞活力检测显示，LDHA的敲除显著地减慢了类器官的生长速度（图7B）。通过IHC染色，在sh-LDHA 类器官中也观察到Ki-67的低表达（图7C）。同时，分析共培养系统中的CD8+T细胞和巨噬细胞。RT-qPCR结果显示，共培养时，T细胞杀伤基因和免疫检查点基因（IFNG、GZMB、PDCD1和CTLA4）的表达显著升高，而巨噬细胞M2相关标志物（CD206、CD163、TGFB和ARG1）的表达降低，M1相关标志物（IL1A、IL1B和CD80）的表达增加（图7D）。这些结果表明sh-LDHA 的类器官中巨噬细胞从原瘤转向抗肿瘤。此外，流式细胞术分析显示sh-LDHA组的CD8+T细胞具有更强的抗肿瘤活性和增殖能力（图7E-G），巨噬细胞更倾向于抗肿瘤M1极化（图7H-K）。用KPC细胞（sh-NC和sh-LDHA）注射到小鼠的腹部外侧产生皮下肿瘤，并在第9、12和15天腹腔注射抗IgG或抗PD1（图7L）。与sh-NC组相比，sh-LDHA组抗PD1治疗效果更显著，肿瘤减少更明显（图7M，N）。IHC结果还表明，sh-LDHA的肿瘤具有丰富的免疫细胞浸润和较慢的肿瘤增殖（图7O）。实验结果表明，LDHA影响免疫细胞的状态，低表达的LDHA提高了它们在胰腺癌免疫治疗中的疗效。

图 7

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