IF6.7/Q1,代谢组+网络药理学揭示黄芪皂苷IV对酒精性肝病的保护作用！
题目：代谢组学结合网络药理学揭示黄芪皂苷IV对酒精性肝病的保护作用
英文名：Metabolomics combined with network pharmacology reveals the protective effect of astragaloside IV on alcoholic liver disease
杂志：Phytomedicine
影响因子：6.7/Q1
发表时间：2024年9月
研究背景：酒精性肝病（ALD）是造成肝损伤的重要因素。然而，治疗ALD的临床方案却很有限。黄芪皂苷IV（AST-IV）是从黄芪（AM）中分离出来的一种皂苷。本研究旨在通过整合代谢组学和网络药理学，探索AST-IV在ALD中的潜在作用机制。
研究思路：用Sprague-Dawley(SD)大鼠建立ALD大鼠模型，开展实验评价AST-IV对ALD的保肝作用。测量了大鼠的体重、肝脏指数、ALT、AST、TC、TG、炎症指标（IL-1β、IL-6和TNF-α）和氧化应激标记物（SOD、MDA），并使用H&E和ORO染色来评估AST-IV和MDA的保肝效果，初步了解AST-IV在ALD中的潜在作用。随后，进行了非靶向代谢组学研究，预测AST-IV对ALD大鼠脂质代谢的影响。代谢组学可以全面地分析生物体内代谢物的变化，从而揭示药物对机体代谢的调节作用。然后，采用网络药理学方法确定了AST-IV矫正脂质代谢紊乱的核心靶点，并通过分子对接、qRT-PCR和Western Blot分析验证了这些靶点。最后，利用斯皮尔曼相关分析法计算了ALD相关生化指标、不同肝脏代谢物和核心靶点之间的关系，结果表明AST-IV可改善肝癌大鼠肝细胞的病理损伤并减少脂质积累，研究流程见图1。
图1
研究结果：
1、AST-IV可改善乙醇诱导的ALD大鼠肝损伤
在喂食乙醇的28天内，大鼠体重显著下降（图2A），喂食乙醇导致肝指数、血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶水平显著升高，表明肝损伤严重，同时TG和TC水平升高，表明脂质代谢紊乱（图2B-F）。H&E和ORO染色法进一步证实了这一点，由于乙醇喂养，肝细胞中出现了不规则的肝索、空泡化以及脂质堆积现象（图2G和H）。此外，大鼠肝脏细胞核Nrf2、CAT蛋白和血清。SOD水平降低，细胞质Nrf2、Keap1、HO-1蛋白和血清MDA水平升高，表明乙醇诱导的氧化应激作用显著（图3A、B）。此外，炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平随着ALD的进展而升高（图3C-E）。每天灌胃50、100或200毫克/千克AST-IV和10mg/kgPPC在肝脏组织学、脂质代谢、氧化应激和炎症方面显示出对乙醇诱导的肝损伤的有效保护（图2A-H、3A-E）。这些研究结果表明，AST-IV可改善乙醇诱导的大鼠肝损伤。
图2
图3
2、AST-IV可纠正ALD大鼠肝脏脂质代谢紊乱的问题
在肝脏中，OPLS-DA图明确区分了对照组、EtOH组和EtOH+AST组（图4A和B）。此外，PCA评分图显示，代谢物在对照组和乙醇组之间，以及乙醇组和乙醇+AST-IV组之间有明显的差异（图4C）。这些发现表明，AST-IV可改善乙醇引起的肝脏代谢紊乱。使用OPLS-DA（VIP>1）和t检验（P<0.05）确定差异代谢物。对照组和EtOH组之间共发现811个差异代谢物（图4D），EtOH组和EtOH+AST-IV组之间共发现745个差异代谢物（图4E），对照组与EtOH组、EtOH组与EtOH+AST-IV组之间共发现544个重叠差异代谢物（图4F）。绘制了一张热图来显示三组重叠差异代谢物的强度水平（图5a）。图5B显示了重叠差异代谢物前15个通路的KEGG通路富集分析，突出显示了涉及精氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢、坏死、核苷酸代谢、糖共磷脂酰肌醇（GPI）-锚生物合成、鞘脂代谢、甘油磷脂代谢以及牛磺酸和低牛磺酸代谢的通路。由于ALD以脂肪肝和肝细胞坏死为特征，脂质代谢、坏死途径和代谢物相应变化之间的联系见图5C。
图4
图5
3、AST-IV通过作用于脂质代谢途径和靶点改善ALD
采用网络药理学方法，从蛋白质水平研究了AST-IV治疗ALD的机制。AST-IV靶点从四个数据库中获得，确定了235个AST-IV靶标。使用搜索词"酒精性肝病"，检索肝病靶标通，发现了803个与ALD相关的基因。通过维恩图分析，确定了63个AST-IV和ALD的共同靶标（图6A）。利用Cytoscape（图6B）将AST-IV靶点和共同靶点可视化，随后，针对这些共同靶点构建了一个蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，显示了排名前十的靶点（图6C）。应用Cytoscape的七种算法、维恩对角线分析，最终确定了六个共同的中枢基因：CYP1A2、HMOX1、CYCS、HSP90AA1、MMP2和FGF2（图6D）。构建了一个由六个常见关键基因组成的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络（图6E）。然后对共同靶标进行KEGG富集分析，以确定AST-IV治疗ALD的潜在途径（图6F）。结果显示，AST-IV可能通过亚油酸代谢、药物代谢-细胞色素P450、过氧化物酶体和色氨酸代谢等途径对ALD起作用。
图6
4、AST-IV与核心蛋白的结合力很强
为了进一步验证AST-IV与ALD核心靶标的结合位点和结合能力，使用AutoDock进行了分子对接。RIPK3、MLKL、CYP1A2、CYP2C19、PPARα和PCSK9作为对接受体，AST-IV作为对接配体。对接结果使用PyMOL软件可视化（图7A-F）。结合能用于评估小分子与目标蛋白质之间相互作用的强度。结合能越低，表明复合物越稳定，结合活性越高。结合能显示，AST-IV与RIPK3、MLKL、CYP1A2、CYP2C19、PCSK9和PPARα有很强的结合力。
图7
5、AST-IV可减轻乙醇诱导的肝细胞坏死
乙醇引起的肝损伤通常以肝细胞坏死为特征。为了评估AST-IV对乙醇诱导的肝细胞坏死的保护作用，用电子显微镜观察了不同组大鼠的肝细胞。电子显微镜图显示，AST-IV可减轻乙醇诱导的肝细胞脂质堆积和线粒体肿胀（图8A）。此外，我们还评估了关键坏死相关蛋白的表达水平，包括p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL和MLKL。Western印迹分析表明，乙醇组中p-MLKL和p-RIPK3的水平升高，而AST-IV可减少乙醇诱导的p-MLKL和p-RIPK3的表达（图8B-D）。总之，这些结果表明AST-IV可改善乙醇诱导的脂质积累和肝细胞坏死。
图8
6、核心目标的实验验证与预测结果一致
为了验证网络药理学和分子对接的结果，进行了qRT-PCR和Western印迹来评估核心蛋白的表达。ALD大鼠体内CYP1A2和CYP2C19的mRNA和蛋白水平显著下降，而AST-IV能够逆转这一过程（图9A，D-F）。此外，在EtOH组中，CYP1A2和CYP2C19的mRNA和蛋白质水平均明显下降（图9A，D-F）。与对照组相比，脂质代谢标志物PCSK9的mRNA和蛋白水平升高，PPARа的mRNA和蛋白水平降低。相比之下，AST-IV治疗可使这些mRNA和蛋白水平恢复到与对照组相似的水平（图9B、C、G-I）。这些研究结果表明，AST-IV能纠正乙醇引起的肝脏脂质代谢紊乱。实验验证结果与预测结果一致。实验验证结果与预测结果一致，表明AST-IV可通过靶向CYP1A2、CYP2C19、PSCK9和PPARα来缓解大鼠的ALD。
图9
7、与ALD相关的血清生化指标、核心靶标和肝脏差异代谢物具有相关性
为了进一步阐明AST-IV减轻ALD的机制，对ALD相关生化指标、核心靶点和肝脏差异代谢物进行了斯皮尔曼相关性分析（图10A）。为了直观地表示这些相关性，用关联构建了涉及ALD相关生化标志物、核心靶标和肝脏差异代谢物的网络（图10B）。总之，这些结果表明，AST-IV可通过抑制乙醇诱导的坏死和改善脂质代谢来减轻ALD。
图10
总结：本文思路清晰，采用生信分析+实验验证相结合的研究方法，揭示了揭示黄芪皂苷IV对酒精性肝病的保护作用！傲星生物深耕生信分析十余载，有丰富的实验方案、完善的下游验证、机制研究服务，一对一专属服务为您排忧解难，助您轻松应对毕业和晋升！
