IF:14.3！网络毒理学+网络药理学，双剑合璧，登顶Advanced Science！

题目：α-硫辛酸通过促进鸡肝细胞中过氧化物酶体β-氧化和减少脂自噬来改善砷诱导的脂质紊乱

英文名：α-Lipoic Acid Ameliorates Arsenic-Induced Lipid Disorders by Promoting Peroxisomal β-Oxidation and Reducing Lipophagy in Chicken Hepatocyte

杂志：Advanced Science

影响因子：2025年1月30日

发表时间：14.3

研究背景：肝脏疾病对全球公共健康构成重大威胁，砷（As）被认为是导致肝损伤的主要环境毒素。α-硫辛酸（LA）通常被称为硫辛酸和1,2-二硫环戊烷-3-戊酸，是一种天然抗氧化剂，研究表明，LA 在体外和体内都能促进生长、增强抗氧化作用、调节脂质代谢、减轻毒素的影响、提高免疫力、抑制细胞凋亡、降低内质网应激和抑制脂质沉积。然而，α-硫辛酸（LA）的具体机制和保护作用仍不清楚。

研究思路：本研究利用网络毒理学和网络药理学全面分析了As的肝毒性机制和LA的保肝机制，并进一步验证了这一过程中过氧化物酶体β氧化和噬脂作用的机制。网络分析结果表明，As主要通过自噬、细胞凋亡、脂质代谢和氧化应激诱导肝损伤，而LA主要通过调节脂质代谢发挥保肝作用。进一步验证发现，As抑制SIRT1的表达，激活P53和Notch通路，损伤线粒体，抑制过氧物酶体β氧化，增加脂质积累，增强肝脏的脂吞噬功能；而LA通过靶向SIRT1，改善线粒体损伤，增强过氧物酶体β氧化，从而减轻As诱导的肝损伤，减轻As诱导的脂质积累，增强脂吞噬功能。这项研究进一步阐明了As肝毒性的机理，为LA作为一种潜在的保肝药物提供了理论依据。

研究结果：

1、对砷诱发肝损伤潜在机制的网络毒理学分析

通过CTD、GeneCards数据库，筛选出754个与As相关的靶基因和1410个与肝损伤相关的靶基因（图1A）。GO、KEGG富集分析显示，As主要通过调节自噬、凋亡、脂质代谢和氧化应激等相关通路，影响肝细胞的氧化应激、增殖、分化、凋亡、自噬、脂质代谢和炎症等生物学过程，从而诱发肝损伤（图1B-D）。

图1

2、LA改善了砷诱发的肝脏结构和功能损伤

根据网络毒理学分析和文献综述，发现LA的生物功能与As的肝毒性机制有明显重叠。结果表明，经过20周的治疗，As导致鸡体重下降，肝脏中天门冬氨酸氨基转移酶（AST）含量升高，而与As组相比，400mgkg −1 LA干预可增加鸡体重，降低肝脏中AST含量（图2A,C）。与20周的结果不同，As和LA在治疗32周后对体重和器官系数没有显著影响。然而，As明显升高了肝脏中的谷草转氨酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平，LA的干预明显缓解了这些升高（图2A-D）。此外，病理学和形态学观察显示，暴露于As20周和32周后，肝脏颜色变浅，肝索排列紊乱，脂滴增多，肝细胞核溶解和坏死加剧（图2E,F）。然而，LA干预可有效改善上述砷诱导的病理和形态学改变，其中400mgkg −1 LA具有更明显的保护作用（图2E,F）。

图2

3、LA潜在保肝机制的网络药理学分析

为了进一步研究LA的潜在保肝作用，采用了网络药理学方法来鉴定和分析与LA相关的关键靶基因和生物学特征。在SwissTargetPrediction和TargetNet数据库中筛选出125个与LA相关概率大于0的潜在靶基因（图3A）。此外，GO富集分析结果显示，LA主要作用于脂质代谢相关的术语，其中与不饱和脂肪酸代谢过程和脂质储存负调控关系最为密切，分别占20.23%和19.21%（图3B-D）。此外，脂质代谢相关靶基因的KEGG富集分析显示，它主要与PPAR信号通路、P53信号通路、Notch信号通路、脂肪分解调控和鞘脂信号通路等通路有关（图3E）。此外，分析还发现SIRT1是LA的一个关键靶点，分子对接结果表明SIRT1蛋白有多个结合口袋，能以较低的结合能与LA稳定结合（图3F,G）。

图3

4、LA可改善砷诱发的肝脂代谢紊乱

为进一步验证As的肝毒性机制和LA的保肝机制，本研究采用油红O染色、脂质代谢相关指标检测、RT-PCR和Western印迹法评估As和/或LA对肝脏脂质代谢的影响。结果表明，As暴露20周和32周后，会明显促进肝脏中总胆固醇（TG）、总胆固醇（T-CHO）和低密度脂蛋白（LDL）的积累，并降低高密度脂蛋白（HDL）的水平（图4A-D）。与脂质检测结果一致，油红O染色结果显示，治疗20周和32周后，肝脏中脂质（红色阳性区域）含量和脂滴数量增加，而LA干预可显著降低肝脏脂质含量（图4F）。油红O染色和肝脏As含量的统计分析显示，As暴露后红色阳性面积和肝脏As含量均显著升高，而LA的干预能有效缓解这些变化（图4E、G）。对关键基因的进一步检测发现，As暴露会显著升高肝脏中P53和Notch1的蛋白表达水平，而LA干预能有效降低这两种蛋白的表达（图4H,I）。这些结果表明，LA，尤其是400mgkg −1 ，对缓解As暴露诱导的肝脏脂质代谢紊乱有一定的作用，而这种紊乱是由P53和Notch通路调控的。

图4

5、LA可减轻As对肝脏过氧物酶体β氧化的抑制作用

用LA干预后，ATGL、LIPA和ACOX1的mRNA表达水平显著增加，而ACACA、FASN和CPT2的mRNA表达水平则大大低于As组（图5a）。与mRNA检测结果一致，ATGL和ACOX1的蛋白表达水平在As组明显降低，但在LA干预后明显升高（图5B,C）。线粒体和过氧化物酶体β氧化是脂质分解的核心生物过程。检测结果表明，As处理明显降低了乙酰-CoA和mtDNA的含量，而添加LA则有效抵消了这种降低（图5D,E）。此外，As明显降低了肝脏中乙酰-CoA合成关键基因（ACSS2和ACLY）的mRNA表达水平，而LA的干预则显著上调了ACSS2和ACLY的mRNA表达（图5F）。此外，如图5G所示，LA的干预显著降低了As诱导的PMP70（过氧化物酶体表面受体）和PLIN2（脂滴表面受体）蛋白表达水平的升高。使用PMP70标记过氧物酶体的进一步免疫荧光染色显示，As处理增加了肝脏中的过氧物酶体，而LA的干预则有效逆转了这一变化（图5H），这表明过氧物酶体β氧化参与了LA缓解As诱导的脂质沉积的过程。

图5

6、LA可降低As诱导的肝细胞嗜脂性

采用免疫荧光染色、RT-PCR和Western印迹技术来进一步探讨噬脂在LA介导的改善As引起的肝脏脂质沉积中的作用。如图6A所示，与Ctrl组相比，As组噬脂体的荧光强度增强，表明噬脂体增加。与Ctrl组相比，As组LC3的mRNA表达显著增加，P62的mRNA表达显著减少（图6B）。As组LC3和P62的蛋白表达量显著增加，而LA干预组LC3和P62的蛋白表达量低于As组，与Ctrl组相比无显著差异（图6C,D）。上述结果表明，As暴露通过增加噬脂性诱导肝细胞损伤，而LA可减少噬脂性，减轻肝细胞损伤。

图6

7、LA可改善砷诱导的肝细胞损伤和脂质代谢紊乱，TRCDA可抑制体外过氧化物酶体β氧化作用

如图7A和B所示，随着As浓度的增加和处理时间的延长，肝细胞的增殖率明显下降。此外，随着LA浓度的增加，细胞的增殖率也相应降低。然而，25、50、75和100µmLA的干预明显缓解了As处理导致的肝细胞增殖率下降（69.89%），相应的增殖率分别为84.92%、89.29%、89.58%和86.97%（图7C）。基于上述结果，本研究确定在后续的细胞模型研究中，As的处理浓度为10µmolL −1 ，LA的处理浓度为25µmolL −1 ，处理时间为24h。研究发现，LA的关键靶蛋白SIRT1被As下调，而LA能有效上调SIRT1的表达，这与体内研究结果一致（图7D）。而LA的干预则提高了肝细胞中蛋白的表达水平（图7F,G），这表明LA在细胞水平上对改善脂质代谢紊乱具有与体内观察到的相似的作用。

ACOX1蛋白检测结果表明，LA干预增加了ACOX1蛋白的表达，而As处理降低了ACOX1蛋白的表达，而TRCDA处理进一步降低了ACOX1蛋白在肝细胞中的表达（图7H,I）。这些研究结果表明，TRCDA抑制了过氧物酶体β-氧化，而β-氧化与As诱导的肝毒性调控和LA对肝脏的保护作用有关。

图7

8、TRCDA促进了砷诱发的脂质代谢紊乱和脂肪吞噬，同时降低了LA改善这两种情况的效果

采用肝细胞功能和脂质含量指标检测、荧光染色和流式细胞术检测过氧化物酶体β氧化抑制对LA改善As诱导的肝细胞损伤和脂质代谢紊乱的影响。如图8所示，As处理显著增加肝细胞的肝功能指标（AST和ALT，图8A）、脂代谢指标（TG和T-CHO，图8B）、细胞死亡率（图8C-E）、ROS含量（图8D,E）、细胞外酸化率（ECAR，图8F）、线粒体膜去极化率（图8G），但增加了肝细胞的耗氧率（OCR，图8F）。

图8

本研究还从LA改善As诱导的肝损伤的角度研究了过氧化物酶体β氧化对噬脂的调控作用。结果表明，As处理明显增加了肝细胞中噬脂荧光点的强度和数量，升高了肝细胞脂滴中LC3、ULK和P62的蛋白表达水平，降低了肝细胞脂滴中mTOR的蛋白表达水平，但LA的干预缓解了As诱导的上述变化（图9A-E）。此外，TRCDA处理进一步促进了As诱导的噬脂相关指标的变化，同时抑制了LA对As诱导的噬脂的改善作用（图9A-E）。这些结果表明，过氧物酶体β氧化调节噬脂作用，并在LA改善As诱导的肝损伤中发挥了重要作用。

图9

总结：本文旨在探讨α-LA对As诱导的鸡肝脂质紊乱的改善作用及其潜在机制。这篇文章将网络药理学和网络毒理学的思路很值得学习，很有创新性！如果复现有困难，可以联系我们定制方案，傲星生物深耕生信分析十余载，有丰富的实验方案、完善的下游验证、机制研究服务，一对一专属服务为您排忧解难，助您轻松应对毕业和晋升！