IF:6.0/Q1，单细胞分析+机器学习+单基因分析，揭示SLC7A1在骨肉瘤中的作用！

题目：SLC家族转运体的单细胞图谱分析：揭示SLC7A1在骨肉瘤中的作用

英文名：Single-cell profiling of SLC family transporters: uncovering the role of SLC7A1 in osteosarcoma

杂志：Journal of Translational Medicine

影响因子：6.0/Q1

发表时间：2025年1月22日

研究背景：骨肉瘤是儿童和青少年最常见的恶性骨肿瘤，致残率和死亡率都很高。在过去的三十年中，治疗效果一直不理想，这凸显了对创新治疗靶点的迫切需要。溶质运载体（SLC）家族转运体与多种肿瘤的恶性进展有关，但它们在骨肉瘤中的具体作用仍鲜为人知。

研究思路：本研究利用数据库单细胞测序数据和RNA-seq数据进行分析。研究人员进行了LASSO回归分析，以确定预后基因并构建SLC相关预后特征。生存分析和ROC分析评估了预后特征的有效性，评估免疫浸润状态。为了研究SLC7A1、恶性表型和免疫微环境之间的关系，还进行了伪时间和CellChat分析。CCK8测定、EdU染色、集落形成测定、Transwell测定和共培养系统用于评估SLC7A1对细胞增殖、转移和巨噬细胞极化的影响。最后，虚拟对接确定了靶向SLC7A1的潜在药物。

研究结果：

1、骨肉瘤scRNA-seq数据集中SLCs的分布情况

为了研究骨肉瘤中溶质载体（SLC）家族基因的分布，利用单细胞RNA测序数据集进行了分析。降维和聚类显示了八个主要细胞系：B细胞、内皮细胞、成纤维细胞、髓样细胞、NK/T细胞、破骨细胞、骨肉瘤（OS）细胞和周细胞（图 1 A）。这些细胞类型在不同样本中的比例各不相同（图 1 B）。气泡图显示了每种细胞类型的比例表达水平和特定标记物的比例（图 1 C），而火山图则说明了各系间显著差异表达的基因（图 1 D）。利用CellChat分析，我们发现了不同细胞类型之间的多种相互作用（图 1 E、F）。

图1

单细胞测序数据揭示了不同细胞类型中溶质运载体（SLC）超家族基因不同的表达模式（图 2 A、B）。破骨细胞的SLC得分highest，其次是骨髓细胞和B细胞，然后是OS细胞，而其他细胞类型的得分较低（图 2 C）。进一步分析发现，破骨细胞的CM-SLC和NM-SLC得分相对较高，骨髓细胞的AAM-SLC得分较高，肿瘤细胞的NM-SLC得分仅次于破骨细胞（图 1 A，图 2 D-E）。与此相反，不同类型细胞的LM-SLC得分都很低（图 2 F）。

图2

2、基于SLC和生存分析构建骨肉瘤预后风险评分模型

采用LASSO惩罚性Cox回归分析来确定与预后相关的SLC家族基因（图 3 A、B）。该分析确定了九个预后基因（图 3 C）。生存期分析表明，与低风险组相比，高风险组的总生存期明显较短（图 3 D、E）。在测试集和外部验证队列 中也观察到了类似的结果（图 3 F-I）。随后，构建了一个包含临床参数和SLC风险模型，表明在预测总生存率方面具有良好的准确性（图 3 J- L）。

图3

3、骨肉瘤患者SLC相关预后特征的免疫图谱

GO富集分析结果显示，差异基因在与通过质膜粘附分子的嗜同性细胞粘附、免疫球蛋白介导的免疫反应和激活免疫反应相关的通路中明显富集（图 4 A、B）。免疫细胞浸润分析显示，发现了高风险组和低风险组之间幼稚CD4T细胞和记忆激活CD4+T细胞浸润的差异，巨噬细胞、肥大细胞和单核细胞的浸润水平在两组之间存在显著差异（图 4C-E）。

免疫检查点基因的差异表达分析表明，CD274、CD44、CTLA4、ICOS、KIR3DL1、LAG3、NPR1、TIGIT和TNFSF4在低危组的表达水平显著高于高危组（图 4 G）。SLC7A1与活化的NK细胞和单核细胞呈显著负相关，而与活化的树突状细胞（DC）呈正相关（图 4 H）。这些研究结果表明，SLC家族基因的表达与骨肉瘤的免疫调节有关，突显了它们在免疫微环境中的潜在调节作用。

图4

4、骨肉瘤细胞中SLC7A1的单细胞分析

气泡图显示，SLC7A1的表达水平升高，在OS细胞中表达细胞的比例较高（图 5 A）。进一步的聚类分析将OS细胞分为五个不同的组，每个组都有独特的基因表达谱（图 5 B、C）。值得注意的是，SLC7A1阳性细胞主要出现在OS4组（图 5 D-F）。使用Monocle算法推断OS细胞的分化轨迹（图 5 G），确定OS4组细胞占据了这一轨迹的末端（图 5 H），SLC7A1的表达在这一轨迹上有显著差异（图 5 I、J）。用scMetabolism算法评估了各肿瘤组的代谢途径活性，发现与SLC7A1的高表达一致，OS4细胞在精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢以及糖酵解/葡萄糖生成等途径中表现出更强的活性（图 5 K）。对14个肿瘤特征基因组的评分显示，SLC7A1阳性细胞具有更强的增殖和转移能力，以及更强的干性（图 5 L）。

图5

5、SLC7A1在体外促进骨肉瘤的增殖和转移，并与预后不良有关

免疫印迹显示，SLC7A1在肿瘤组织中上调（图 6 A）。随后，选择了143B和SJSA-1骨肉瘤细胞系，并在体外进行了SLC7A1基因敲除（图 6 B）。这种敲除导致增殖能力降低（图 6 C），这也表现在EdU阳性细胞比例降低和集落形成减少（图 6 D、E）。此外，SLC7A1敲除还能显著抑制两种细胞系的细胞侵袭、迁移和成球能力（图 6 F-H）。为了验证SLC7A1对预后的影响，使用免疫组化技术（IHC）分析了70例骨肉瘤标本中SLC7A1的表达情况（图 6 I）。Kaplan-Meier分析显示，SLC7A1高表达与较差的总生存期和无肺转移生存期相关（图 6 J）。单变量和多变量回归分析均确定SLC7A1水平是一个独立的预后因素（图 6 K）。这些研究结果表明，SLC7A1可能是骨肉瘤有价值的治疗靶点和预后标志物。

图6

6、SLC7A1表达与肿瘤免疫微环境的关系

根据肿瘤细胞中SLC7A1的水平将15个单细胞样本分为SLC7A1高表达组和低表达组。分析结果显示了不同的细胞类型组成，高表达组中髓系细胞明显减少（图 7 A）。对分离出的髓样细胞进一步降维和聚类，发现了四种不同的类型图 7 B-D）。对细胞组成的再分析证实，高表达组的TAMs显著减少（图 7 E）。

对TAMs进行了代谢分析，发现SLC7A1高表达组的精氨酸生物合成增强，而精氨酸和脯氨酸代谢减弱，表明这种微环境中可能存在精氨酸缺乏（图 7 F）。细胞通讯分析发现肿瘤细胞与巨噬细胞之间的相互作用频率更高、强度更大（图 7 G）。与其他免疫细胞相比，TAM从骨肉瘤细胞接收到更多的信号（图 7 H）。进一步比较高SLC7A1表达组和低SLC7A1表达组之间的细胞间通讯表明，高SLC7A1表达组的骨肉瘤细胞向TAMs发出了更多的信号，尽管信号强度略有降低（图 7 I）。并进行了差异信号通路分析（图 7 J-K）。

图7

7、SLC7A1影响M2巨噬细胞的极化

采用共培养模型研究了骨肉瘤细胞中SLC7A1的表达对肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）分化的影响（图 8 A）。流式细胞术显示，与对照组细胞相比，SLC7A1-敲除组的CD206表达明显减少，CD86表达略有增加（图 8 B、C）。此外，qPCR分析表明，M2巨噬细胞标记物，包括CD206、ARG1、IL-10、TGFB1和CD163有明显上调（图 8 D）。这些发现表明，骨肉瘤细胞中SLC7A1的表达促进了微环境中M2样巨噬细胞的极化。

图8

8、基于结构的虚拟筛选确定头花千金藤碱是SLC7A1的潜在抑制剂

通过基于结构的虚拟筛选，以确定可能抑制SLC7A1功能的已批准药物（图 9 A）。使用AlphaFold2预测了SLC7A1蛋白结构（图 9 B），预测的配准误差图显示大多数区段的置信度很高（图 9 C）。该模型的质量与核磁共振和X射线晶体学得出的模型质量相当（图 9 D）。这些药物的分子对接可视化图以白色显示SLC7A1蛋白模型，蓝色棒状显示药物分子，黄色虚线显示氢键，并标注了参与相互作用的氨基酸残基（图 9 E-N）。

图9

在10µM的浓度下进一步筛选这10种药物（图 10 A）。IC50分析表明，Cepharanthine（CPE）（5.13µM）对骨肉瘤细胞的半抑制浓度minimum（图 10 B）。细胞热转移试验（CETSA）表明，CPE能抑制热诱导的SLC7A1蛋白降解（图 10 C），随着浓度的增加，CPE增强了对精氨酸摄取和细胞增殖的抑制作用（图 10 D、E）。为了评估CPE预处理对骨肉瘤细胞诱导的巨噬细胞极化的影响，收集了用或不用CPE预处理24小时的骨肉瘤细胞的条件培养基，并将其用于培养THP1衍生的巨噬细胞（图 10 F）。培养48小时后，流式细胞术分析表明，CPE预处理显著下调了CD206的表达，上调了CD86的表达，这些效应随着CPE浓度的增加而增强（图 10 G、H）。这些研究结果表明，千金藤素通过与 SLC7A1 结合并抑制其活性发挥抗肿瘤作用。

图10

总结：本文的分析，可以看作是“单基因”分析的升阶版！从SLC转运蛋白基因家族切入，重点是单细胞分析与机器学习构建预后模型，最后进行了单基因分析，常规实验验证。文章方法易复现，傲星生物不仅具有丰富的分析经验、还提供完善的下游验证、机制研究服务，一对一专属服务为您排忧解难，助您轻松应对毕业和晋升！