IF:12.4，网络药理学+转录组+机制实验，解析隐丹参酮防止腹主动脉瘤形成！
题目：通过隐丹参酮靶向平滑肌细胞Keap1-Nrf2-GSDMD-焦亡轴可防止腹主动脉瘤形成
英文名：Targeting the smooth muscle cell Keap1-Nrf2-GSDMD-pyroptosis axis by cryptotanshinone prevents abdominal aortic aneurysm formation
杂志：THERANOSTICS
影响因子：12.4
发表时间：2024年10月07
研究背景：腹主动脉瘤（AAA）是一种炎症性、致命的主动脉疾病，目前缺乏任何有效的药物。隐丹参酮（CTS）是一种突出且廉价的生物活性物质，来源于丹参Bunge，这是一种众所周知的草药，通过其强大的抗炎特性治疗心血管疾病。然而，CTS对AAA形成的治疗效果仍然未知。
研究思路：为探讨CTS对AAA的治疗效果，采用多种实验方法，主要包括AAA小鼠模型建立、实时聚合酶链反应（PCR）、RNA测序、蛋白质印迹、免疫共沉淀、扫描/透射电子显微镜（SEM/TEM）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、seahorse分析、免疫组化和共聚焦成像。在这项研究中，作者证明CTS抑制了输注AngII的载脂蛋白E敲除（ApoE-/-）小鼠中AAA的形成。网络药理学和转录组测序分析的结合表明，血管平滑肌细胞（VSMC）中Keap1-Nrf2通路的激活和程序性细胞死亡的调节与CTS的抗AAA作用密切相关。利用分子对接，结合细胞热位移测定（CETSA）和等温滴定量热法（ITC），在CTS和Keap1之间的Arg415位点建立了一个特定的结合位点。
研究结果：
1、CTS抑制AngII诱导的ApoE-/- 小鼠AAA形成
使用了AngII诱导的小鼠AAA模型，十二周大的雄性ApoE-/-小鼠在AngII输注当天每天给予低剂量或高剂量的CTS（CTS-L或CTS-H）或载体（图1A）。在实验终点，AngII输注组的收缩压高于生理盐水组，无论是否使用CTS治疗都没有显着差异（图1B）。高剂量的CTS显著提高了小鼠AAA模型中的存活率（图1C-D）。相比之下，CTS-L组只有46.7%（7/15）的小鼠和CTS-H组只有26.7%（4/15）的小鼠出现了AAA（图1D）。还观察到CTS治疗后maximum腹主动脉直径显著降低（图1E-F）。
图1
H&E和EVG染色表明CTS大大减轻了弹性蛋白的损伤和恶化（图1G-I）。此外，CTS治疗导致剂量依赖性相当大且阳性区域较小（图1J）。AngII灌注小鼠主动脉中层的VSMCs与生理盐水对照小鼠相比，α-SMA和SM22α水平显著下降，而CTS有效地挽救了α-SMA和SM22α的下降（图1J-L）。CTS处理小鼠主动脉中的MMP活性显着降低（图1M-N）。这些结果表明CTS阻碍AAA的形成，并维持血管平滑肌细胞稳态AngII诱导小鼠AAA模型。
2、CTS在体外AAA模型中协调VSMC表型、炎症、氧化应激和线粒体功能
CTS剂量依赖性地抑制了TNF-α诱导的血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）和基质金属蛋白酶（MMP2、3和9）的蛋白表达，这在RAVSMCs（图2A）和MAVSMCs中起着关键作用。如图2B所示，CTS以剂量相关的方式增加弹性蛋白表达，同时防止TNF-α-诱导的RAVSMCs和MAVSMCs中SMC收缩表型标志物SM22α和α-SMA表达的减少。通过DHE染色和流式细胞术评估的ROS水平在TNF-α或AngII处理中显着升高，而CTS有效地抑制了这种升高（图2C-H）。因此，抗氧化剂超氧化物歧化酶（SOD）水平和ATP水平降低，而在TNF-α暴露的VSMCs和AngII处理的小鼠血清中，氧化应激指标丙二醛（MDA）水平升高，CTS阻止了这种影响（图2I-L）。CTS处理减少了细胞培养上清液中的LDH释放（图2M）。CTS处理后，细胞表现出接近正常的形态，没有明显的超微结构损伤（图2N）。此外，TNF-α处理诱导VSMCs的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）显著增加，而CTS处理有效地逆转了TNF-α诱导的线粒体功能障碍和糖酵解增加（图2O-P）。将VSMCs暴露于TNF-α会导致细胞质dsDNA和mtDNA数量的增加，而CTS处理逆转了这种影响（图2Q-R）。
总体而言，这些发现表明CTS抑制VSMC炎症、ROS产生和线粒体损伤，从而在TNFα诱导的AAA 体外模型中维持VSMC稳态。
图2
3、网络药理学结合RNA-seq分析表明，CTS激活Keap1-Nrf2-HO-1通路并抑制细胞死亡通路
为了绘制AAA中CTS交互目标的全局地图，使用了网络药理学（图3Aa-b）。在这个集中的网络中，以黄色标记的十个目标在AAA中至关重要，并且已被证明与AAA的进展密切相关，特别是Keap1-Nrf2-HO-1信号轴（图3Ac-d）。
图3
CTS主要富集的途径集中在炎症反应和细胞死亡的类别上（图3B）。火山图显示，当暴露于CTS时，由转录因子Nrf2调节的靶基因增加，与其他基因相比，Hmox-1（HO-1的基因名称）表现出最显着的上调（图3C）。热图显示与载体组相比，CTS实验组中Nrf2靶基因的高转录（图3D）。此外，差异表达基因的KEGG分析表明，CTS对炎症和细胞死亡途径的调节有显著影响，与网络药理学的发现一致（图3E）。在GO富集分析中，很明显CTS对“Keap1-Nrf2途径”产生了影响，与网络药理学的结果一致（图3F）。
4、CTS激活Keap1-Nrf2-HO-1通路并抑制VSMC中的焦亡通路以预防AAA
根据网络药理学和RNA-seq的发现，CTS治疗在体内诱导了AngII灌注小鼠主动脉介质中VSMCs中Nrf2和HO-1的稳健蛋白表达（图4A-B）。进一步分析CTS对体外培养的VSMCs的影响，发现Keap1蛋白表达减少，Nrf2及其靶蛋白HO-1和NQO1显著增加（图4C）。Nrf2蛋白水平在细胞核和细胞质中均有所增加，其中增加在细胞核中更为明显（图4D）。免疫荧光染色进一步证实了这一点（图4E），表明Nrf2通路显著激活。
图4
RNA-seq数据显示，在TNF-α刺激的VSMCs中，Gsdmd的转录水平升高，而CTS治疗缓解了这种升高（图5a）。通过蛋白质印迹检测到焦亡途径中关键靶点的蛋白质水平，包括NLRP3、Cle-Caspase1、N-GSDMD、IL-1β和IL-18，并显示在AngII注入的小鼠主动脉组织或TNF-α处理的RAVSMCs中显着增加，同时被CTS抑制（图5B-E）。此外，IHC证实了小鼠主动脉横截面中NLRP3、Caspase1和GSDMD的表达（图5F-G），ELISA测定证实了小鼠血清中IL-1β、IL-18和其他两种关键的AAA相关细胞因子（TNF-α和IL-6）的释放（图5H）。最后，用相差显微镜和扫描电镜观察焦亡的形态学变化。在相差显微镜下，细胞呈现气球状形态。此外，SEM观察到VSMCs在TNF-α刺激下细胞大小肿胀和细胞膜上形成孔隙的明显迹象，而CTS治疗改善了异常形态学（图5I-J）。
图5
5、CTS直接结合Keap1的Arg415残基激活Nrf2通路，改善氧化应激和炎症
使用CETSA、分子对接分析和ITC来确定CTS和Keap1之间是否存在直接接触。测定表明CTS对增加Keap1的热稳定性有实质性影响，Tm50为11.68°C（图6A）。此外，ITDRF-CETSA测定提供了进一步的证据，证明了IC50为2μM的CTS对Keap1蛋白的剂量依赖性结合和显着稳定（图6B）。分子对接分析显示CTS对Keap1的Arg415（R415）残基具有highest的亲和力（图6C）。Keap1R415K蛋白与CTS的热稳定性显著下降，与Keap1WT蛋白相比，Tm50值为7.41°C（图6D）。CTS对Keap1WT蛋白表现出更高的结合亲和力，而对突变的Keap1没有观察到明显的结合（图6E-F）。此外，Co-IP测定显示CTS治疗显著降低了Keap1蛋白水平与VSMCs中的Nrf2结合（图6G）。还观察到CTS处理后Nrf2的泛素化水平降低（图6H）。这些发现表明CTS直接与Keap1中的Arg415残基相互作用，从而阻碍Keap1和Nrf2之间的结合，阻止Nrf2泛素化和随后的降解，导致Nrf2逃逸和易位到细胞核以开始细胞保护基因的转录。
图6
DHE染色和流式细胞仪显示，在转染Keap1-WT的VSMCs中，CTS处理后ROS水平显着提高，但在Keap-R415K转染的细胞中没有（图7A-B）。此外，将Keap1R415K转染VSMCs显著抑制CTS诱导的Nrf2和HO-1蛋白表达上调（图7C-D）。此外，Western blot表明，CTS在转染Keap1WT的VSMCs中具有抗炎和抗焦亡作用，但在Keap1R415K中没有（图7C-D）。总之，CTS与Keap1中415位点氨基酸的结合对改善至关重要。
图7
6、在体外 AAA模型中，抑制Keap1-Nrf2通路可逆转CTS的保护作用
在ML385存在的情况下，CTS对MMPs（MMP2、3和9）以及VCAM-1蛋白水平的消除被完全消除（图8A）。观察到MMPs和AAA相关细胞因子（Il1b、Il6和Ccl2）的mRNA水平的类似结果（图8B）。此外，ML385部分损害了CTS恢复弹性蛋白和SMC收缩表型标志物（SM22α和α-SMA）蛋白水平的能力（图8C）。ML385处理也逆转了CTS介导的抗氧化能力，如使用流式细胞术（图8D-E）和DHE染色检测ROS水平所示（图8F-G）此外，CTS对NLRP3-Cle-Caspase1-N-GSDMD介导的焦亡的抑制作用通过ML385给药被废除（图8H）。总之，这些结果表明，CTS通过激活Nrf2在体外模型中在AAA中维持VSMC稳态并抑制VSMC焦亡。
图8
7、VSMC特异性 Nfe2l2 敲低消除了小鼠AAA模型中CTS的保护作用
荧光成像显示AAV特异性感染主动脉而不是其他器官（图 9 A）。小鼠主动脉的横截面显示GFP在中层中特异性表达（图 9 B）。此外，western blot分析表明，在AAV2病毒存在的情况下，大脑中Nrf2蛋白的表达是一致的，而主动脉明显降低（图 9 C）。将病毒注射到ApoE-/-小鼠中，以建立上述AngII诱导的小鼠AAA模型（图 9 D）。正如预期的那样，观察到CTS有效抑制了AngII注入的ApoE-/- 小鼠的AAA形成。有趣的是，当Nrf2在小鼠VSMC中沉默时，抑制作用减弱，如AAA发生率增加、存活率降低和腹主动脉maximum直径增加所示（图 9 E-H）。此外，组织学评估描述了Nrf2缺陷与CTS治疗效果受损之间的直接联系。这表现为显着的外膜增厚、弹性蛋白碎裂增加以及主动脉内层内胶原含量的显着降低（图 9 I-J）。免疫组织化学分析证实了这些发现，表明AAV介导的shNfe2l2 有效抑制了CTS诱导的VSMC中Nrf2的稳定和激活（图 9 K）。进一步的免疫荧光研究表明，CTS给药显着上调了VSMC中的Nrf2表达。使用AAV-shNfe2l2 阻碍了这种上调，同时导致α-SMA蛋白水平降低（图 9 L）。通过ELISA检测细胞因子，包括IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α，结果显示与AngII输注小鼠相比，CTS处理的小鼠明显减少。然而，CTS的治疗效果在很大程度上被Nrf2敲低所抵消（图 9 M）。
图9
此外，免疫组织化学染色显示，VSMCs中的Nrf2敲低通过增加炎症、促进VSMC表型转换和提高MMP水平来阻断CTS的治疗效果。尽管CTS治疗可以通过激活Nrf2介导的通路和弹性蛋白水平来改善AAA，但还是观察到了这一点（图 10 A），突出了Nrf2是AAA治疗的关键治疗靶点。Western blot分析进一步证明，Nrf2敲低大大削弱了Nrf2通路的激活以及NLRP3和焦亡通路的抑制（图 10 B）。综上所述，这些数据表明CTS通过激活Nrf2介导的抗炎作用和抑制NLRP3-caspase1引发的细胞焦亡，在治疗AAA方面很有希望。
图10
总结：本文通过网络药理学与转录组测序、分子对接并结合细胞热位移测定（CETSA）和等温滴定量热法（ITC）等湿实验，探究隐丹参酮 (CTS)对AAA的治疗效果的方式，是个很好的例子。傲星生物深耕生信分析十余载，有丰富的实验方案、完善的下游验证、机制研究服务，一对一专属服务为您排忧解难，助您轻松应对毕业和晋升！
