IF：6.7，网络药理学+机器学习！内容详实，堪称发文模板！
题目：解毒三根汤抗结直肠癌的生物活性成分：一种新颖、全面的天然药物开发研究策略
英文名：Bioactive components of Jiedu Sangen decoction against colorectal cancer: A novel and comprehensive research strategy for natural drug development
杂志：Phytomedicine
影响因子：6.7
发表时间：2025年4月21日
研究背景：结直肠癌（CRC）发病率和死亡率高，传统中药解毒三根汤（JSD）临床疗效显著但活性成分未知。中药复方成分复杂，需结合多技术解析其作用机制，推动天然药物开发。
研究思路：通过UPLC-MS/MS筛选JSD入血成分及代谢物，结合RNA-seq、网络药理学、机器学习（AHP-SOM算法）筛选关键活性成分与靶点，利用分子对接、分子动力学模拟及实验（SPR、MST）验证相互作用，阐明其抗CRC机制。
研究结果：
1、JSD显著抑制结直肠癌细胞体外增殖
JSD干预SW620细胞48小时和72小时的半数抑制浓度（IC50）如图1A所示，因此后续实验的浓度梯度设定为0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml和3mg/ml。平板克隆实验证实，2mg/ml和3mg/ml的JSD可有效减少SW620细胞的增殖（如图1B和C所示）。不同浓度梯度JSD干预SW620细胞7天的增殖曲线也证实了上述观点（如图1D所示）。流式细胞术检测细胞凋亡和EdU实验也证实，随着JSD浓度的增加，对SW620细胞增殖的抑制作用更加明显（如图1E、F和H所示），图片统计结果如图1G和I所示。
图1
2、JSD化学成分谱的表征
鉴于中药复方所含物质的复杂性，使用UPLC-MS/MS对JSD进行高通量成分分析是天然药物开发的具体体现。图2A和B分别显示了JSD在正离子和负离子模式下的总离子流图（TIC），鉴定出的主要峰标记为1-102。典型的化合物碎片模式如图2C和D所示。
图2
3、JSD成分在大鼠血浆中的检测与表征
如图3所示，空白血浆、含药血浆和JSD的TIC存在显著差异，表明仅通过表征水煎液的成分来解释中药复方的疗效是片面的。共鉴定出18种原型成分和8种可能的代谢物，包括4种黄酮类、5种萜类、5种苯丙素类、3种酚类、2种蒽醌类和7种其他成分。
图3
图4
4、RNA-seq分析JSD干预结直肠癌细胞的综合表征
对JSD干预后的SW620细胞进行RNA-Seq分析，获得了183个上调的mRNA和235个下调的mRNA（图5a）。对差异表达基因进行GO、KEGG和GSEA富集分析，发现它们集中在多个与结直肠癌相关的信号通路，如PI3K-Akt信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路，以及凋亡、免疫反应、脂质运输和铁离子结合等生物学过程和分子功能（图5B-D）。功能聚类分析发现，差异表达的mRNA集中在跨膜运输、T细胞增殖和凋亡的负调控（图5E）。热图和GO富集分析表征了JSD干预SW620细胞后变化的非编码RNA（图5F-H）。进一步进行共表达分析，以阐明JSD干预后差异表达的编码和非编码基因之间的相关性（图5I）。
图5
5、网络药理学分析JSD生物活性成分抗CRC的潜在靶点和机制
基于TCGA和GTEx数据库，获得了11,326个结直肠癌和正常组织中的差异表达基因。然后，结合TCMSP、Pubchem、SwissTarget等数据库，获得了JSD的18种入血成分和8种可能代谢物的1372个潜在靶点。取上述两者的交集，获得了JSD生物活性成分抗CRC的232个潜在靶点（图6A）。对上述232个靶点进行网络分析和可视化（图6B）。对上述可能的靶点进行GO和KEGG富集分析，发现它们集中在炎症反应、凋亡和中性粒细胞趋化等生物学过程。这些靶点作用于细胞外区域、细胞膜、内质网和染色体等多个细胞区域（图6C）。它们显著富集在PI3K/Akt信号通路、氮代谢等信号通路（图6D）。绘制了JSD-活性成分-潜在靶点-机制通路图（图6E），为后续探索JSD抗CRC的有效生物活性成分及其分子生物学机制提供了方向。
图6
6、生物信息学分析探索CRC关键靶点的生存预后及机器学习推导JSD核心生物活性成分
将获得的JSD生物活性成分抗CRC的232个潜在靶点与JSD干预SW620细胞后转录组测序获得的差异表达基因相结合，获得了6个关键靶点：CA9、DOK7、DPEP1、NOTUM、CALB2和AKAP12（图7A）。对TCGA、GTEx和HPA数据库的分析显示，CA9、DOK7、DPEP1和NOTUM在CRC中上调，而CALB2和AKAP12在CRC中下调（图7B和C）。JSD对6个靶点的调节如图S4B所示。使用HPA数据库对TCGA-COADREAD进行预后分析，发现关键靶点与患者的OS和PFI等预后密切相关（图7D）。同时，它们的表达还与CRC患者的TMN分期和CEA水平相关（图7E）。诊断ROC分析显示，关键靶点可有效指示CRC的发生（图7F）。接下来，分析了TCGA数据库中CRC患者中这6个关键靶点之间的相关性以及与免疫细胞浸润的相关性。AKAP12和CALB2之间、NOTUM和DPEP1之间存在较强的相关性（图7G）。总体而言，NOTUM、DPEP1、DOK7和CA9的表达增加伴随着各种免疫细胞的减少，而AKAP12和CALB2则观察到相反的现象（图7H）。JSD血浆中存在的26种生物活性成分与6个关键靶点的分子对接表明，大多数活性成分可能与关键靶点具有稳定的结合（图7I）。利用神经元之间的关系进一步验证，染料木黄酮、阿夫泽林和白藜芦醇是Most潜力的生物活性成分（图7J）。综上所述，获得了JSD最有希望的生物活性成分及其干预CRC的关键靶点（图7K）。
图7
7、核心生物活性成分与关键靶点的分子对接和分子动力学模拟及验证
图8A显示了机器学习获得的JSD的6个关键靶点与3个最有希望的生物活性成分之间的分子对接结合能。选择结合能minimum的三对“蛋白质-小分子”复合物进行后续的分子动力学模拟和实验验证（黄色圆圈表示）。图8B-D是6个关键靶点最稳定结合位点的示意图。
图8
染料木黄酮-NOTUM、阿夫泽林-DPEP1和白藜芦醇-CA9均位于靶蛋白的结合位点，并在模拟过程中表现出良好的进入模式（图9A和B，图10A和B，图11A和B）。例如，白藜芦醇的芳香环渗透到CA9的疏水核心区域；染料木黄酮的双酚环与NOTUM进入结合口袋；阿夫泽林的糖苷部分面向DPEP1的极性残基，苯环嵌入疏水核心。总能量为负表明复合物在热力学上趋于稳定。阿夫泽林-DPEP1复合物的范德华能为-40kcal/mol，表明强疏水相互作用支持结合的稳定性（图9C，图10C和图11C）。CA9的关键残基（如Leu、ARG等）对范德华力和静电能有显著贡献，反映了这些残基在结合位点稳定性中的作用（图9D）。NOTUM蛋白中的氨基酸残基对能量有显著贡献，这些残基有助于增强染料木黄酮的结合稳定性（图10D）。
图9
图10
DPEP1中的疏水残基和极性氨基酸对能量有显著贡献，表明蛋白质与阿夫泽林之间结合紧密（图11D）。RMSD、SASA、Rg和RMSF分析表明，三种小分子（白藜芦醇、染料木黄酮、阿夫泽林）在相应的蛋白质结合位点表现出稳定的结合能力，结合后未诱导蛋白质的全局构象变化。靶蛋白整体保持稳定结构，结合位点在结合后表现出良好的适应性调整（图9E-I，图10E-I和图11E-I）。此外，使用SPR和MST技术评估分子动力学模拟的准确性。SPR实验具有明显的结合信号，拟合结果在浓度梯度范围内，表明结合具有特异性（图9J，图11J和图13R）。MST拟合曲线呈“S”形，具有明显的上下平台和强浓度依赖性，表明结合具有特异性（图9K，图11K和图13S）。
JSD的三种最有希望的生物活性成分对SW620细胞的杀伤作用及其对各自关键靶点的mRNA和蛋白质水平的抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性趋势（图10A-C，图10J-L，图12A-C，图12G-I和图13J-M）（图10D-F，图10M-O，图12D-F，图12J-L，图13K-L和图13N-Q）。结合上述KEGG富集通路结果，对白藜芦醇和染料木黄酮干预后的SW620细胞进行相应的WB实验，初步证明白藜芦醇可能通过CA9/PI3K/AKT通路促进CRC细胞凋亡，染料木黄酮可能靶向NOTUM下调b-catenin表达抑制CRC细胞增殖（图10G-H和图12M-N）。上述所有结果证明了研究策略揭示JSD抗CRC的“黑箱”理论的可行性，并为小分子药物的开发提供了全方位的支持。
图11
图12
图13
总结：本研究建立了一种新颖的综合研究策略，鉴定出JSD的核心活性成分为白藜芦醇、染料木素和阿夫泽林，靶点为CA9、NOTUM和DPEP1，并揭示其通过调控PI3K/AKT和β-catenin信号通路发挥抗CRC作用，为天然药物开发提供了新方向。傲星生物深耕生信分析十余载，有丰富的实验方案、完善的下游验证、机制研究服务，一对一专属服务为您排忧解难，助您轻松应对毕业和晋升！
