题目：补肾健脾调血汤（BJTD）通过激活SIRT1/NRF2通路改善子宫衰老诱导的氧化应激和细胞凋亡

英文名：Bushen Jianpi Tiaoxue Decoction (BJTD) ameliorates oxidative stress and apoptosis induced by uterus ageing through activation of the SIRT1/NRF2 pathway

杂志：Phytomedicine

影响因子：6.7/Q1

发表时间：2024年11月22日

研究背景：子宫老化是导致老年女性生育能力下降的关键因素，也与月经失调、子宫内膜炎和子宫腺肌病有关。补肾健脾调血汤（BJTD）是一种中药制剂，用于改善女性生殖系统的内分泌失调，并广泛应用于与衰老相关的子宫内膜疾病。然而，其改善子宫衰老的机制尚未得到彻底研究。

研究思路：使用苏木精和伊红染色观察形态学变化，使用Masson染色评估胶原蛋白沉积，并使用Western blot检测凋亡相关分子。确定建模剂量后，以2次剂量进行BJTD干预，并测量氧化应激和细胞凋亡相关基因和蛋白质的表达。使用TUNEL检测试剂盒和AnnexinV/FITC-PI检测试剂盒评估细胞凋亡水平。通过UPLC-MS测定BJTD的主要成分，并使用网络药理学和分子对接探索BJTD作用的潜在靶点和机制。提取含BJTD的血清（BJTD-S）并使用人子宫内膜基质细胞（hESC） 进行体外实验，以初步确定受影响的通路。

研究结果：

1、D-半乳糖诱导衰老激活子宫炎症、胶原沉积和细胞凋亡

最初采用两种建模方法，即颈部后连续皮下注射5周，分别使用200毫克/千克/天（D-Gal 200）和600毫克/千克/天（D-Gal 600）的剂量来诱导子宫衰老，以明确建模剂量（图1A）。结果表明，两种建模方法都降低了子宫指数，但只有D-Gal 600建模导致统计学上显著差异（图1B）。此外，两种建模方法都增加了子宫组织中TNF-α和IL-1β的水平，表明炎症反应的促进作用（图1C-D）。HE染色结果显示，用两种剂量的D-Gal建模的小鼠表现出与衰老相关的相似形态学变化（图1E）。Masson染色结果显示，两种剂量的D-Gal建模导致子宫组织胶原纤维沉积（图1F）。Western blot结果显示，两种建模小鼠的衰老标志物p53显著增加。虽然相对于对照组，BCL-2水平下调，BAX表达上调，但仅在D-Gal 600模型中观察到统计学意义上的差异（图1G-J）。

图1

2、BJTD改善D-Gal诱导的炎症和氧化应激

选择D-Gal 600建模为基础，研究BJTD的功效（图1A）。采用RT-qPCR检测部分senescence-associated分泌表型（SASP）标志物的mRNA水平（图2A-B）。随后，使用ELISA试剂盒检测蛋白质水平，表明BJTD干预可能通过post-transcriptional调控发挥其效果（图2C-D）。D-Gal显著降低SOD和GSH-Px的表达，以及T-AOC水平。两种剂量的BJTD均显著提高T-AOC，而只有BJTDH显著提高SOD和GSH-Px水平。此外，D-Gal显著增加MDA水平，BJTDH和BJTDL均显著降低MDA水平（图2E-H）。

图2

3、BJTD抑制D-Gal诱导的细胞凋亡中炎症诱导激活的凋亡级联信号

HE染色结果显示，BITD部分减轻了D-Gal诱导的子宫形态损伤，减少了子宫内膜上皮细胞肿胀和基质细胞空泡（图3A）。TUNEL-POD染色显示，两种剂量的BJTD给药均显著减少了凋亡细胞的数量（图3B）。COX-2和Caspase8的表达在组间没有显著差异（图3C-J）。

图3

4、BJTD-S抑制D-Gal诱导的hESCs细胞凋亡

使用hESCs进行了体外实验，SA-β-gal染色显示，持续24小时的200m MD-Gal干预增加了阳性细胞的数量，表明存在急性衰老（图4A）。CCK-8结果显示，白藜芦醇在hESCs中的IC50为27.17μM;因此，干预浓度设置为13μM（图4B）。在用两种不同剂量的含药物血清和白藜芦醇干预后，D-Gal诱导的hESC细胞死亡受到抑制（图4C-E）。白藜芦醇能够逆转D-Gal诱导的氧化应激，而只有高浓度的BJTD-S才能抑制氧化应激损伤（图4F-G）。细胞凋亡实验表明，白藜芦醇和BJTD-S均显着降低了D-Gal诱导的hESC细胞凋亡的增加（图4I）。

图4

5、hESC衰老的差异基因表达和富集分析

对GEO数据库中的GSE160702数据集进行了分析，获得70个DEGs（图5A）。并进行了GO富集分析、GSEA分析，结果表明，分子功能富集的最重要条目是微管蛋白结合，而其他条目则不显著，该基因集与细胞周期停滞、氧化磷酸化和DNA损伤修复有关（图5B-D）。总之，对这些转录组数据的进一步分析揭示了与子宫基质细胞衰老相关的基因以及与之相关的途径。

图5

6、网络药理学和分子对接揭示了SIRT1是BJTD改善子宫衰老的潜在靶点

根据UPLC-MS检测（图6）、文献统计和数据库预测，获得了化合物的251个潜在靶标和疾病121个潜在靶点（图7A）。以往研究表明，SIRT1是这些靶点之一，从PDB数据库下载了SIRT1的两种构型（4I5I和4ZZI）的结构，从PubChem获得了acteoside、astragalin、formononetin、hyperin、narigenin、quercetin、tiliroside和trigoneline的3D结构。预处理后，使用AutoDockVina进行分子对接，结果表明，具有SIRT1两种构型的每个分子的结合能均小于-5kcal/mol。其中，替利罗苷表现出the best的结合亲和力，对4I5I的结合能为-10kcal/mol，对4ZZI的结合能为-10.3kcal/mol（图7B）。具有两种构型的每个分子的the best结合位置如图7C所示。

图6

图7

7、BJTD介导SIRT1/NRF2通路改善子宫的衰老

对对照组、D-Gal模型和BJTD-S干预组的hESCs进行NRF2和SIRT1的双标签免疫荧光染色。结果表明，NRF2和SIRT1主要分布在hESCs的细胞质中，建模后荧光表达降低，而BJTD干预增强了它们的表达（图8A）。使用Western blot对蛋白质表达进行定量，发现D-Gal建模后SIRT1和NRF2蛋白质水平显著降低，而BJTD显著增加了它们的表达（图8B-F）。再次对子宫组织切片进行NRF2和SIRT1的免疫染色，结果显示，NRF2和SIRT1阳性细胞主要在基质细胞中表达，D-Gal建模后数量明显减少，而两种剂量的BJTD均表现出NRF2和SIRT1阳性细胞增加的趋势（图8G）。子宫组织中HO-1-阳性细胞主要位于子宫内膜基质，建模后数量明显减少，但在BJTD-H干预后数量增加（图8H）。蛋白质定量结果显示D-Gal干预后子宫组织中SIRT1、NRF2和HO-1表达显著降低，仅BJTD-H显著增加这三种蛋白质的表达（图8I-M）。

图8

总结：BJTD可以改善D-Gal诱导的子宫衰老中的氧化应激和细胞凋亡水平，其活性成分可以激活SIRT1/NRF2通路发挥其作用。重要的是，研究为传统中医影响子宫衰老的分子机制提供了新的见解。傲星生物深耕生信分析十余载，有丰富的实验方案、完善的下游验证、机制研究服务，一对一专属服务为您排忧解难，助您轻松应对毕业和晋升！