PCR实验介绍

实验步骤

1、 样本总RNA提取（Trizol法）

1. 取适量待测样本加入液氮后研磨粉碎；

2. 用1ml Trizol将研磨样本转移到取到1.5ml EP管中；

3. 向1.5ml EP管中加入500ul酚氯，仿振荡混匀后，静止5分钟；

4. 4℃ 12000rpm离心10分钟，小心吸取上清于一新的1.5ml EP管中；

5. 向分离出的上清中加入700ul异丙醇，充分混匀；

6. 4℃ 12000rpm离心10分钟，小心弃上清；

7. 用75%乙醇洗涤沉淀一次，室温晾干；

8. 50ul DEPC水溶解RNA沉淀；

9. 琼脂糖凝胶电泳检测。

2、总RNA质量检测

使用核酸浓度测定仪测定RNA浓度和纯度，测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零，操作方法如下：

1.  抬起样品臂，把样品加到检测基座上；

2.  放下样本臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。在上下两个光纤之间会自动拉出一个样品柱，然后进行检测；

3. 当检测完成后，抬起样品臂，并用干净的无尘纸把上下基座上的样品擦拭干净。

浓度测定

260nm处读值为1表示40 ng RNA/µl。样品RNA浓度计算公式为：A260 X 40 ng/µl。

纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法，比值范围1.8到2.1。即使比值超出这个范围，RNA样品也一样可以用于一些普通实验中如Northern杂交，RT-PCR和RNA酶保护实验。

3、逆转录合成cDNA

逆转录使用invitrogen的逆转录试剂盒superscript III

1. 反应体系1建立：

2. 混匀，离心。65℃，5分钟，结束后置于冰上。

3. 反应体系2建立：

4. 混匀，离心。置于42℃，水浴60分钟。

5. 取出后置于85℃，反应10分钟，灭活逆转录酶。

6. 反应结束后将产物置于-20℃待用。

4、实时荧光定量检测

1. Real time PCR反应体系建立：

2. 体系混匀后，瞬离一下，置于荧光定量PCR仪上，按照以下条件反应：

3. Realtime PCR反应条件

结果示例：

合作流程：

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