明胶酶谱实验简介：

明胶酶谱实验是一种用于检测基质金属蛋白酶（MMPs）活性的实验技术，特别是MMP-2和MMP-9这两种在细胞迁移、侵袭和组织修复中起关键作用的酶。明胶酶谱实验可以检测MMP2和MMP9的活性，是分子生物学的常用实验技术之一。该实验通过SDS-聚丙烯酰胺（含0.1%明胶）电泳分离样品，然后在二价金属离子存在的缓冲系统中恢复MMP-2和MMP-9的活性，使凝胶中的明胶在相应的迁移位置处水解，最后用考马斯亮蓝染色并脱色，从而在蓝色背景上显示出白色条带，条带的强度与MMP-2和MMP-9活性成正比。

实验步骤：

1. 样品准备：取对数期癌细胞，并在无血清培养基中培养24小时，收集上清液并保存在-70°C下备用。

2. 蛋白质浓度调整：根据细胞数调整蛋白质浓度，并与上样缓冲液混合。

3. 电泳：在4℃下进行SDS-PAGE电泳约1.5小时。

4. 洗脱：电泳结束后，将凝胶放入洗脱液中振荡洗脱，然后用漂洗液漂洗。

5. 孵育：将凝胶置于孵育液中37℃孵育42小时。

6. 染色与脱色：孵育后，用染色液染色3小时，然后用脱色液进行脱色，直至条带清晰可见。

7. 图像分析：使用凝胶图像分析系统分析并读取谱带面积、宽度和灰度值，进行统计分析。

注意事项：

1. 避免气泡：在制备聚丙烯酰胺时应注意避免气泡。

2. 缓冲液配制：明胶酶谱的活性受钙离子、锌离子和pH值等因素影响，因此缓冲液的制备应严格准确，应使用超纯水，并控制孵育温度。

3. pH值控制：孵育溶液的pH值应在7.5至7.6之间，以保持酶的最佳活性。

4. 避免变性：在样本处理过程中避免样品中的酶发生变性和失活，不宜对蛋白样品进行沸腾处理，且上样缓冲液中应避免含有β-巯基乙醇或DTT。

5. 明胶保存：明胶应储存在4°C下，制备后1周内使用