一、概念：

      慢病毒是一种有包膜的RNA病毒，直径为80-120nm，呈二十面体对称结构、球形。病毒颗粒最外层是包膜(包膜蛋白决定了感染细胞的类型)，再往里依次为基质蛋白和衣壳，最里面是两条相同的正股RNA链和酶(逆转录酶、整合酶和蛋白酶)。

二、应用：

1、慢病毒有广泛的宿主范围，能够有效地感染分裂细胞、非分裂细胞，特别适合于一些难转染的细胞（如原代细胞、干细胞、不分化的细胞）和对腺病毒感染具有较强免疫反应的细胞（如树突状细胞、单核细胞和间充质干细胞）等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加。

2、慢病毒能将外源基因有效地整合入宿主染色体上，介导目的基因稳定、长期的表达。因此，可以利用慢病毒建立稳定细胞株。

3、适用范围更广，不仅能用于体外实验，还能用于活体动物模型，尤其是动物成瘤实验。

三、实验准备

1、状态良好的HEK 293T细胞，一般使用复苏后10代以内的细胞进行慢病毒的生产，要求无细菌、真菌以及支原体污染；

2、转染试剂，如PEI、Higene、lipo2000或lipo3000

各种转染试剂的步骤稍有差别，小助手以PEI为转染试剂。

3、DMEM无血清无双抗培养基、DMEM完全培养基（10%FBS和1%P/S）；

4、10mL无菌注射器(环氧乙烷灭菌处理)；

5、0.45μm的细菌滤器。

四、简要包装步骤

以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1x106个293T细胞

1、取1.5ml灭菌EP管，加入1.5ug包装混合质粒和0.5ug表达质粒以及250ul的无血清培养基。轻柔混5.室温孵育5min。

2、取1.5ml灭菌EP管，取9u脂质体2000|溶于250ml无血清培养基中。轻柔混匀，室温孵育5min。3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20min

4、用胰酶消化并记数293T细胞。用含血清的培养基重悬细胞。

5、在六孔板中每孔，加入1m含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。

6、将1ml重悬的293T细胞(1x106个细胞/m)加入到平板中。37℃CCO2孵箱中孵育过夜7、移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除，代之以DMEM(含丙酮酸钠和非必须氨基酸)7、转染后48-72h收获含病毒的上清。3000 rpm 离心20min，去除沉淀。

8、病毒上清-80°贮存。

包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。

三、慢病毒滴度测定

病毒滴度的单位为：TU/mL，代表每毫升病毒液中具有转导功能的病毒颗粒的数目。

计算公式为：滴度=（感染时细胞数（个）*阳性细胞%）/病毒液体积（mL）

病毒液体积和感染时细胞数已知，需通过流式细胞术确认阳性细胞百分比。

滴度测定常常使用HEK 293T细胞，大致的原理为，将在DAY3收集到的病毒上清，按照梯度添加到293T细胞中，感染后48h检测阳性细胞的比例，从而确定病毒的滴度。

五、注意事项

1、在慢病毒感染细胞前，为检测病毒上清培养液内病毒的活性，并确定病毒与转染细胞之间的比率，需要确定病毒的滴度。病毒的滴度可以通过转染Hela细胞，然后使用抗体筛选稳定的细胞转染株，进行计数和数值统计。

2、在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合，只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞，因此，病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。

3、293T细胞的代数最好用15代以内，最多不超过20代，否则影响转染效率。质粒浓度在400-1000ng/μL范围，纯度260/280在1.8-2.0之间的转染效率较高。混合体轻轻滴入细胞上清后摇匀，动作要轻，293T细胞贴壁不牢避免细胞脱落。