IF:7.5顶刊力证！透明细胞肾细胞癌的预后lncRNA升级思路，创新性与深度兼具！
题目：一种新的干性相关lncRNA特征可预测透明细胞肾细胞癌的预后、免疫浸润和药物敏感性
英文名：A novel stemness-related lncRNA signature predicts prognosis, immune infiltration and drug sensitivity of clear cell renal cell carcinoma
杂志：Journal of Translational Medicine
影响因子：7.5
发表时间：2025年2月27日
研究背景：透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是一种常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤，具有异质性。干性是肿瘤进展、复发和转移的关键因素，但其对ccRCC预后的影响尚不明确。长非编码RNA（lncRNA）可调控基因表达，与ccRCC的增殖、凋亡等过程有关，但干性相关lncRNA（SRlncRNA）在ccRCC中的表达和作用尚不清楚。
研究思路：本研究旨在探讨ccRCC中的SRlncRNA，并开发用于风险分层和预后预测的特征。研究者从TCGA和GEO数据库下载基因表达和临床数据，计算样本的RNA干性得分（RNAss），通过加权相关网络分析（WGCNA）识别SRlncRNA和干性相关mRNA（SRmRNA），并进行功能富集分析。利用多种机器学习算法构建预后特征，在TCGA-KIRC和GSE29609队列中进行训练和验证，并分析在预后、免疫浸润、药物敏感性、突变景观和基因集富集分析（GSEA）等方面的差异。此外，研究者还开发了基于网络的计算器以方便临床应用，并通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）以及体外和体内实验进一步验证SRlncRNA在ccRCC中的表达和作用。
研究结果：
1、SRlncRNAs和SRmRNAs的筛选
基于RNA干细胞评分（RNAss）和加权基因共表达网络分析（WGCNA），在TCGA-KIRC队列中，通过设定软阈值β=6构建共表达网络，识别出与RNAss相关性highest的MEgrey模块，从中筛选出452个干性相关lncRNA（SRlncRNAs）。对于mRNA，MEorange、MElightcyan、MEblack和MEtan模块与RNAss的相关性均≥0.5，共包含1907个mRNA，进一步筛选得到1005个干性相关mRNA（SRmRNAs）（图1A-H）。
图1
2、SRmRNAs的功能富集
从SRmRNAs中鉴定出787个差异表达基因（DEGs），包括413个上调基因和374个下调基因（图2A）。基因本体论（GO）分析显示，这些DEGs主要富集于神经发生正调控、腺体发育、神经元分化正调控等生物学过程，核染色质、转录因子复合体等细胞组分，以及DNA结合转录因子活性等分子功能（图2C）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析表明，DEGs显著富集于EB病毒感染、癌症中的转录失调、细胞衰老和TGF-β信号通路等（图2D）。
图2
3、SRlncRNA特征和ceRNA网络的构建
在TCGA-KIRC队列中，通过101种算法组合及留一法交叉验证（LOOCV），筛选出LASSO回归结合逐步Cox回归为optimal模型（平均C-index=0.716）。该模型最终纳入10个SRlncRNA，经多变量Cox回归确定6个核心SRlncRNA构建预后特征，包括LINC01711、LINC00944、AC245128.3、AL162586.1（风险因子），以及AC002070.1、EMX2OS（图3A-D）。
图3
以中位风险评分将患者分为高、低风险组，TCGA队列中高风险组预后显著更差（图4A-C），1年、3年、5年生存预测的AUC分别为0.762、0.761、0.792（图4D），且C-index高于142个已发表的ccRCC预后模型（图4E）。
图4
使用来自GSE29609队列的数据验证签名。与低风险组相比，高风险组患者的OS明显较短（图5a）。按风险评分升序绘制每位患者的表达热图（图5B）。随着风险评分的增加，死亡患者的比例也增加（图5C）。ROC曲线显示，预测1年、3年和5年生存的签名的AUC值分别为0.800、0.868和0.851（图5D）。与其他99个已发表的签名相比，SRlncRNA签名在GSE29609队列中表现出良好的预测价值（图5E）。
图5
4、功能分析
基因集富集分析（GSEA）结果显示，α-亚麻酸代谢、细胞因子受体相互作用、子宫内膜癌、同源重组和免疫球蛋白A（IgA）产生的肠道免疫网络在高风险组中富集最为显著。而原发性免疫缺陷、前列腺癌、近端小管碳酸氢盐重吸收、紧密连接和血管加压素调节的水重吸收在低风险组中富集（图6A）。同样，GO通路的富集情况如图6B所示。
图6
5、免疫浸润
免疫浸润分析显示，高风险组中性粒细胞、髓系树突状细胞（TIMER算法）及Treg细胞、活化NK细胞等（CIBERSORT算法）浸润水平更高，且免疫功能评分（如干扰素γ产生、白细胞介素17产生）显著升高（图7A-D）。高风险组TIDE评分更低，对免疫治疗反应更好，SubMap分析证实其与免疫治疗队列更相似，CheckMate队列中EMX2OS高表达患者免疫治疗预后更佳（图7E-H）。
图7
6、药物敏感性分析
药物敏感性预测显示，低风险组对比卡鲁胺、拉帕替尼等更敏感，高风险组对JNK抑制剂VIII等敏感；结合L1000FWD、CMap和DGIdb数据库，筛选出7个潜在药物（美苯达唑、柔红霉素等，图8B-C）。
图8
突变分析表明，高、低风险组均以VHL、PBRM1、TTN、SETD2为高频突变基因，但高风险组BAP1和SETD2突变频率更高，且肿瘤突变负荷（TMB）显著升高（P<0.01，图9A-F）。
图9
7、预后预测模型的构建
选择具有完整人口学、临床病理学和预后记录的样本来制作列线图。单变量分析确定年龄、分级、分期、T分期、M分期和风险评分是OS的潜在预测因子（ 图 10 A-B）。基于这些因素，构建了预测OS的列线图（图 10 C）。通过将每个因素的相应分数相加，可以计算出每个患者的总分。该列线图将临床和病理特征与新的SRlncRNA相关预后特征相结合，C统计量为0.770（95%CI0.751-0.790）。
图10
8、SRlncRNAs的单细胞转录组和空间转录组分析
通过分析ccRCC的scRNA-seq数据，筛选出前2000个变量特征，经降维后识别出33个细胞集群，将细胞分为8种细胞类型：恶性细胞、单核细胞/巨噬细胞、上皮细胞、浆细胞、内皮细胞、CD8T细胞、成红细胞和周细胞。EMX2OS和LINC00944在恶性细胞中低表达和高表达，其表达与细胞分化轨迹相关，敲低后影响细胞状态转变（图11A-O）。
图11
计算了每种细胞类型的CNV评分，揭示了恶性细胞的不同特征（图12 A-B）的使用Leiden算法的进一步分析将细胞分为14个不同的集群。值得注意的是，与其他细胞类型相比，恶性细胞的CNV评分显著升高（图 12 C）。在恶性细胞群中，LINC00944表达高的细胞比LINC00944表达低的细胞表现出更高的CNV评分（图 12 D）。
图12
还深入研究了SRlncRNA表达与CytoTRACE评分之间的关联（图 13 A-D）。在所有细胞类型中，恶性细胞的CytoTRACE评分highest（图 13 E），EMX2OS和LINC00944的表达与CytoTRACE评分显著相关。
图13
为了更深入地了解emX2OS和LINC00944在ccRCC中的空间表达模式，对从具有代表性的肿瘤-正常界面获得的空间转录组测序数据进行了全面分析（图 14 A-D）的细胞类型注释如图 14 C、F所示 。在ccRCC中，EMX2OS和LINC00944的表达在tumo和正常组织之间的边界上分布不均匀（图 14 B、E）。
图14
9、ccRCC中EMX2OS和LINC00944的下调影响体外增殖、迁移和侵袭
利用靶向shRNA特异性敲低ccRCC细胞系中EMX2OS和LINC00944的表达，从而对两个靶标实现有效的敲低效率（图 15 A）。为了评估这些细胞的增殖能力，进行了CCK-8和集落形成测定。结果表明，敲低EMX2OS显著促进ccRCC细胞的增殖，而敲低LINC00944显著抑制其增殖（图 15 B、C）。此外，进行了Transwell检测以研究EMX2OS和LINC00944对细胞迁移和侵袭的影响。敲低EMX2OS增强了细胞迁移和侵袭，而敲低LINC00944抑制了这些过程（图 15 D、E;P <0.01对于所有比较）。
图15
10、EMX2OS和LINC00944的下调影响ccRCC细胞的凋亡和细胞周期
伤口愈合试验用于评估ccRCC细胞的迁移能力，显示EMX2OS敲低后迁移能力增加，敲LINC00944后迁移能力降低（图 16 A; 所有比较的P<0.001）。研究发现，敲低EMX2OS 可抑制肾透明细胞癌（ccRCC）细胞系的细胞凋亡，而敲低LINC00944则促进ccRCC细胞的细胞凋亡（图16B）。具体来说，在EMX2OS敲低后，G0/G1期的ccRCC细胞减少，S期细胞的相应增加。相反，敲低LINC00944导致G0/G1期ccRCC细胞增加，而S期细胞减少（图 16 C）。
图16
11、EMX2OS和LINC00944的下调增强了ccRCC的干性
探究了EMX2OS和LINC00944沉默后干性及其相关基因的变化。EMX2OS的下调上调了CD133、EPCAM和SOX2的mRNA和蛋白质水平，并促进了球体形成（图17A、B）。相反，LINC00944的下调下调了干性相关基因的表达，并抑制了球体形成（图17A、B）。将EMX2OS和LINC00944的短发夹RNA（shRNAs）转染到ccRCC类器官中（图17C）。敲低EMX2OS促进了ccRCC类器官的生长，而沉默LINC00944则抑制了ccRCC类器官的生长（图17D）。免疫荧光显示，在沉默SRlncRNA后，类器官中KI67的表达发生了改变，这与在类器官生长中观察到的变化一致（图17E）。异种移植瘤模型显示，sh-EMX2OS组的肿瘤大小和重量均显著增加，而sh-LINC00944组则减小（图17F）。sh-EMX2OS组的肺转移病灶更多，而sh-LINC00944组的病灶较少（图 17G）。 
图17
总结：研究构建了The first oneccRCC干性相关lncRNA特征集，可有效预测预后、免疫浸润和药物敏感性，其中EMX2OS和LINC00944通过调控细胞增殖、迁移等参与肿瘤进展，为ccRCC精准治疗提供新靶点。傲星生物深耕生信分析十余载，有丰富的实验方案、完善的下游验证、机制研究服务，一对一专属服务为您排忧解难，助您轻松应对毕业和晋升！
