题目：6PPD和6PPD-醌的呼吸毒性机制：基于网络毒理学和分子对接的综合研究

英文名：Respiratory toxicity mechanism of 6PPD and 6PPD-quinone: An integrated study based on network toxicology and molecular docking

杂志：Ecotoxicology and Environmental Safety

影响因子：6.1

发表时间：2025年6月11日

研究背景：6PPD作为广泛使用的橡胶抗氧化剂，主要通过轮胎-路面磨损颗粒释放到环境中，其臭氧衍生物6PPD-Q是城市径流死亡综合征的主要毒性因子。两者通过颗粒物和气溶胶传播，对呼吸系统产生有害影响，但具体致病机制尚不明确。现有研究多聚焦于其神经毒性、生殖毒性和发育毒性，缺乏对呼吸毒性的系统评估，亟需阐明其对人体呼吸系统健康风险的分子机制。

研究思路：本研究整合网络毒理学、分子对接和分子动力学模拟技术，首先通过数据库预测6PPD和6PPD-Q的呼吸毒性潜力，再通过多数据库挖掘筛选两者的潜在靶点，结合GeneCards和OMIM数据库分类的急慢性呼吸损伤相关靶点进行交集分析，构建蛋白质相互作用网络并筛选核心靶点，通过GO、KEGG和DO富集分析解析核心靶点参与的生物学过程和信号通路，借助分子对接验证化合物与核心靶点的结合能力及模式，最后通过分子动力学模拟验证关键靶点复合物的稳定性，从而系统阐明6PPD和6PPD-Q诱导呼吸毒性的分子机制和关键靶点。

研究结果：

1、6PPD诱导急性呼吸系统疾病（ARD）的靶点筛选与富集分析

本研究通过PubChem数据库检索6PPD获取其标准结构（图1A）。最初从BindingDB、ChEMBL、SwissTargetPrediction和TargetNet数据库中筛选出154个6PPD靶点。利用GeneCards和OMIM数据库分别确定肺水肿（1004个）、急性肺炎（892个）、急性肺损伤（ALI，1160个）、急性呼吸窘迫综合征（ARDS，1242个）和急性支气管炎（3139个）的相关靶点，合并去重后共获得4104个ARD相关靶点。通过韦恩图分析鉴定出6PPD与ARD靶点之间共82个潜在交集靶点（图1B），并构建“毒性化合物-靶点-疾病”（TTD）网络图（图1C）。

利用STRING数据库构建包含76个节点和619条边的PPI网络，平均节点度为16.3。使用Cytoscape3.8.2分析PPI网络的拓扑特性（包括度中心性DC、介数中心性BC、紧密中心性CC、最·大团中心性MCC、最·大邻域组件密度DMNC和最·大邻域组件MNC）并可视化网络图（图1D）。根据度中心性，排名前六的靶点为HIF1A、NFKB1、ESR1、SRC、EGFR和PPARG。随后对76个交集靶点进行富集分析。GO分析显示，排名前十的生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）条目主要涉及信号转导、基因表达调控、代谢过程、蛋白质功能与相互作用以及细胞结构与定位（图1E），这些功能与外源性物质应答和免疫反应密切相关。KEGG分析表明，交集靶点主要参与信号转导和细胞应答相关通路（如MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路）以及免疫和炎症相关通路（如Th17细胞分化和趋化因子信号通路）（图1F）。所有GO和KEGG富集结果均与6PPD诱导的急性呼吸系统损伤密切相关。接下来，分别从DC、BC、CC组和DC、MCC、DMNC、MNC组中独立筛选核心靶点。具体而言，第一组鉴定出12个重叠靶点（图1G、H），第二组鉴定出1个重叠靶点（图1I）。将两组重叠靶点合并去重后，与GSE68610、GSE261559和GSE283072数据集的差异表达基因（DEG）进行交叉分析，最终鉴定出7个在ARD中显著差异表达的核心靶点：NFKB1、HIF1A、EGFR、RELA、MAPK14、NR3C1和JAK2。筛选结果通过多组环形火山图可视化（图1J）。

图1

2、6PPD诱导慢性呼吸系统疾病（CRD）的靶点筛选与富集分析

通过GeneCards和OMIM数据库鉴定间质性肺病（ILD，1351个）、慢性肺损伤（CLI，59个）、慢性支气管炎（1143个）和特发性肺纤维化（IPF，1115个）的相关靶点，合并去重后共获得2594个CRD相关靶点。利用韦恩图筛选出6PPD与CRD靶点之间的55个潜在交集靶点（图2A），并绘制TTD网络图（图2B）。通过STRING数据库构建包含50个节点和335条边的PPI网络，平均节点度为13.4。使用Cytoscape3.8.2分析并可视化PPI网络的拓扑特性（图2C）。根据度中心性，排名前六的靶点为HIF1A、NFKB1、EGFR、SRC、PPARG和RELA。随后对55个交集靶点进行富集分析。GO分析显示，交集靶点主要参与信号转导、免疫反应、代谢调控、基因表达调控、氧化应激以及细胞结构与定位（图2D）。KEGG分析表明，交集靶点主要参与免疫反应和炎症（如T细胞受体信号通路、Th1/Th2细胞分化）、信号转导（如HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路）、细胞代谢与分化（如鞘脂信号通路）（图2E）。这些结果表明，6PPD与CRD的交集靶点主要与免疫反应调控、信号转导、细胞代谢、氧化应激以及神经和生殖系统相关。按照相同流程，分别鉴定出12个（图2F、G）和4个（图2H）重叠靶点。将两组重叠靶点合并去重后，与GSE40839、GSE188464和GSE236857数据集的DEG进行交叉分析，最终鉴定出5个在CRD中显著差异表达的核心靶点：EGFR、PPARG、NR3C1、CYCS和JAK2。筛选结果通过多组环形火山图可视化（图2I）。

图2

3、 6PPD诱导呼吸毒性核心靶点的分子对接

通过韦恩图分析确定6PPD与ARD和CRD核心靶点的并集（9个）和交集（3个）靶点（图3A）。对这些并集靶点的疾病本体（DO）富集分析显示，核心靶点主要与呼吸系统、消化系统、皮肤、代谢、免疫系统、恶性肿瘤和神经退行性疾病相关（图3B、C），其中呼吸系统疾病主要包括哮喘和支气管疾病。尽管食管炎属于消化系统疾病，但气溶胶颗粒可能吸入并沉积于食管，因此值得关注。对6PPD与3个交集靶点（EGFR、NR3C1、JAK2）进行分子对接研究。AutoDock生成的结果显示，三个靶点的结合能均低于-20.9kJ/mol（-5kcal/mol）。具体而言，6PPD与EGFR的结合能为-26.23kJ/mol（图3D），属于中等结合强度；与NR3C1的结合能为-29.68kJ/mol（图3E），与JAK2的结合能为-30.24kJ/mol（图3F），均显示出强结合能力。这些发现表明6PPD与核心交集蛋白具有显著亲和力，尤其是NR3C1和JAK2，提示它们在6PPD诱导呼吸毒性的分子机制中起关键作用。

图3

4、6PPD-Q诱导急性呼吸系统疾病（ARD）的靶点筛选与富集分析

本研究通过PubChem数据库检索6PPD-Q获取其标准结构（图4A）。从四个靶点预测数据库中鉴定出200个6PPD-Q的潜在靶点。利用韦恩图筛选并确定6PPD-Q与ARD相关靶点之间的108个潜在重叠靶点（图4B），并基于这些结果构建TTD网络图（图4C）。通过STRING数据库构建包含89个节点和646条边的PPI网络，平均节点度为14.5。使用Cytoscape3.8.2分析PPI网络的六种拓扑特性并可视化网络图（图4D）。根据度中心性，排名前六的靶点为PTGS2、GSK3B、CYCS、RELA、JAK2和ABL1。随后对89个交集靶点进行富集分析。GO分析显示，这些靶点主要与信号转导、细胞增殖、免疫反应、炎症反应、凋亡调控和细胞组分结构功能相关（图4E）。KEGG分析表明，交集靶点主要参与信号转导和细胞增殖（如MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路）、神经功能（如血清素能突触、神经活性配体-受体相互作用）以及免疫反应和炎症（如钙信号通路、凋亡）（图4F）。所有GO和KEGG富集结果表明，6PPD-Q与ARD的交集靶点主要与炎症反应失衡、程序性细胞死亡抑制、细胞功能障碍和神经调控失衡相关。按照上述方法，分别筛选出11个（图4G、H）和1个（图4I）重叠靶点。将两组重叠靶点合并去重后，与GSE68610、GSE261559和GSE283072数据集的DEG进行交叉分析，最终鉴定出9个在ARD中显著差异表达的核心靶点：PTGS2、RELA、MCL1、MMP2、MAPK14、APP、FYN、KDR和CDK2。筛选结果通过多组环形火山图可视化（图4J）。

图4

5、6PPD-Q 诱导慢性呼吸系统疾病（CRD）的靶点筛选与富集分析

利用韦恩图鉴定出 6PPD-Q 与 CRD 靶点之间的 83 个潜在交集靶点（图 5·A），并构建 TTD 网络图（图 5B）。通过 STRING 数据库建立包含 71 个节点和 400 条边的 PPI 网络，平均节点度为 11.3。使用 Cytoscape 3.8.2 分析并可视化 PPI 网络的六种拓扑特性（图 5C）。根据度中心性，排名前六的靶点为 PTGS2、JAK2、MMP2、GSK3B、NR3C1 和 RELA。随后对 71 个交集靶基因进行富集分析。GO 分析显示，这些基因主要参与信号转导、免疫反应、炎症反应、神经调控、代谢和细胞功能（图 5D）。KEGG 分析表明，这些交集靶基因主要参与免疫细胞激活与分化（如 T 细胞受体信号通路、Th17 细胞分化）、信号转导（如钙信号通路、Rap1 信号通路）、细胞黏附与迁移（如黏着斑通路）、细胞增殖（如 PI3K-Akt 信号通路）、炎症反应（如趋化因子信号通路）和神经调控（如神经活性配体 - 受体相互作用）（图 5E）。上述富集分析结果表明，6PPD-Q 与 CRD 的交集靶点主要与信号转导异常、细胞黏附与迁移受损、持续性炎症反应以及神经和免疫系统功能障碍相关。按照相同流程，分别鉴定出 11 个（图 5F、G）和 3 个（图 5H）重叠靶点。将两组重叠靶点合并去重后，与 GSE40839、GSE188464 和 GSE236857 数据集的 DEG 进行交叉分析，最终鉴定出 4 个在 CRD 中显著差异表达的核心靶点：JAK2、FYN、NR3C1 和 CYCS。筛选结果通过多组环形火山图可视化（图 5I）。

图5

6、6PPD-Q诱导呼吸毒性核心靶点的分子对接

通过韦恩图分析确定6PPD-Q与ARD和CRD相关核心靶点的并集（12个）和交集（1个）（图6A）。对这些并集靶点的DO富集分析显示，核心靶点主要与免疫、神经、血管、呼吸、消化、皮肤和代谢系统疾病相关（图6B、C），其中呼吸系统疾病主要包括鼻窦炎和特发性间质性肺炎。此外，细胞因子风暴作为一种全身性炎症状态，在肺组织中尤为显著，是急性肺损伤相关疾病的主要病因之一（Zhou等，2023）。对6PPD-Q与唯·一的交集蛋白FYN进行分子对接以研究其相互作用（图6D）。AutoDock生成的分子对接结果显示，6PPD-Q与FYN的结合能为-29.01kJ/mol，表明中等结合强度。这种强相互作用提示FYN在6PPD-Q诱导呼吸毒性的分子机制中起重要作用。

图6

7、6PPD和6PPD-Q核心靶点的联合分析

对6PPD和6PPD-Q诱导急慢性呼吸毒性的核心靶点进行富集分析。GO分析显示，尽管两者均干扰信号转导，但涉及的通路存在显著差异：6PPD优先激活病毒/LPS应答相关通路（如TLR/NF-κB），并通过microRNA双向调控RNA聚合酶II转录；而6PPD-Q特异性靶向VEGFR信号通路，通过FYN介导的肽酪氨酸磷酸化调节膜筏功能。在基因表达水平上，6PPD通过HIF1A/PPARG调控代谢相关microRNA网络，而6PPD-Q通过DNA结合转录因子（如RELA）促进蛋白质核转运，表明两者可能分别通过表观遗传重塑和转录后修饰发挥毒性作用。在免疫反应方面，6PPD诱导的Th17分化和PD-1/PD-L1checkpoint抑制与病毒防御机制相关；而6PPD-Q通过IL-1β生成和IL-17通路激活中性粒细胞浸润，导致急慢性炎症的差异表现（图7A、B）。KEGG通路比较分析进一步证实了这些差异：6PPD主要驱动HIF-1/ROS致癌轴和非酒精性脂肪肝代谢紊乱，其与EGFR的相互作用（-26.23kJ/mol）增强细胞异常增殖；而6PPD-Q显著富集于VEGF/PI3K-Akt通路和动脉粥样硬化网络，其靶点KDR和CDK2协同促进血管渗漏和细胞周期紊乱。值得注意的是，尽管两者均富集于PD-1/Th1-Th2免疫调控模块，但6PPD通过NR3C1抑制糖皮质激素抗炎作用，而6PPD-Q通过APP调控神经退行性通路（图7C、D），这些发现凸显了其毒理学机制的器官特异性倾向。通过韦恩图分析，鉴定出6PPD和6PPD-Q与呼吸毒性相关的5个重叠靶点（呼吸毒性靶点总数：6PPD为9个，6PPD-Q为11个）：NR3C1、MAPK14、RELA、CYCS和JAK2（图7E），这些靶点构成呼吸毒性的共同调控枢纽。PPI网络和KEGG富集分析表明，这些靶点通过多层次相互作用驱动共同的损伤机制（图7F、G）：具体而言，RELA和JAK2形成转录调控模块，协同激活IL-17/Toll样受体通路，导致Th1/Th17分化失衡和T细胞功能异常；MAPK14-RELA复合物通过TNF/NOD样信号轴触发NF-κB依赖性炎症反应；而CYCS介导的线粒体凋亡与呼吸上皮细胞死亡密切相关。

图7

8、呼吸毒性关键靶点的分子对接

由于已完成6PPD与NR3C1和JAK2的分子对接，本研究重点分析6PPD与其他三个关键毒性靶点（RELA、MAPK14、CYCS）的相互作用（图8A-C）；而6PPD-Q则与所有五个核心交集蛋白（NR3C1、RELA、MAPK14、CYCS、JAK2）进行分子对接（图8D-H）。AutoDock生成的分子对接结果显示，所有结合能均低于-20.9kJ/mol（-5kcal/mol）。其中，6PPD与CYCS的结合能最·低（-38.37kJ/mol），其次是6PPD-Q与CYCS（-34.94kJ/mol），两者均与CYCS形成两个氢键，提示CYCS可能是毒性化合物诱导呼吸毒性的关键靶点。此外，6PPD与MAPK14（-32.66kJ/mol）以及6PPD-Q与MAPK14（-33.96kJ/mol）的相互作用也显示出强结合强度；6PPD-Q与NR3C1（-28.41kJ/mol）、RELA（-21.93kJ/mol）和JAK2（-27.15kJ/mol）的相互作用为中等结合强度。这些结果（表2）表明核心交集蛋白与6PPD和6PPD-Q均具有强亲和力，尤其是CYCS和MAPK14，提示这些蛋白在两者诱导呼吸毒性的分子机制中起关键作用。

图8

9、关键毒性靶点CYCS的分子动力学模拟验证

基于分子对接实验，CYCS与6PPD和6PPD-Q均显示出显著的结合活性。本研究采用分子动力学模拟（MDS）评估这些复合物的稳定性。CYCS-6PPD复合物的MDS结果（图9A）显示，均方根偏差（RMSD）快速收敛至平衡状态，均方根波动（RMSF）范围为0.05-0.2nm，回转半径（Rg）保持稳定，证实复合物构象的动态稳定性；氢键数量（0-3个）和结合能（ΔE_MMPBSA=-65.08±2.48kJ/mol，表3）进一步验证了CYCS与6PPD之间的强相互作用。相比之下，CYCS-6PPD-Q复合物（图9B）的RMSD波动范围显著增大，RMSF也有所增加（范围为0.05-0.25nm），且Rg值波动明显；此外，氢键数量（0-2个）和结合能（ΔE_MMPBSA=-33.25±3.25kJ/mol，表3）显著低于6PPD复合物。构象重叠分析证实，6PPD可稳定占据CYCS活性口袋内的优势结合位点（图9C）；而6PPD-Q分子在模拟过程中表现出多位点分布特征，表明其与CYCS的亲和力不足以维持稳定的结合构象（图9D）。6PPD-Q与CYCS结合呈多位点分布的关键原因在于结构修饰：与6PPD相比，臭氧衍生物6PPD-Q的苯环上新增两个氧原子，形成醌样结构，这种修饰增加了其极性，降低了分子构象灵活性，并增强了吸电子效应（Yuan等，2020），最终导致其与CYCS蛋白疏水性结合口袋的亲和力降低，难以形成稳定结合。

图9

总结：本研究通过多种计算毒理学技术，明确了6PPD和6PPD-Q诱导急慢性呼吸毒性的特异性靶点（6PPD为EGFR，6PPD-Q为FYN）和5个共有靶点（NR3C1、MAPK14、RELA、CYCS、JAK2），证实两者通过破坏线粒体电子传递链、紊乱凋亡通路及激活NF-κB/JAK-STAT炎症级联反应诱导呼吸炎症，其中CYCS和MAPK14为高亲和力关键靶点。研究建立了两者的比较毒理学框架，为环境污染物呼吸毒性的风险评估提供了新方法，也为相关疾病的诊断和防治提供了理论依据。