IF:6.7，“千年古方焕发新生！网络药理学揭示黄芪郁金抗癌核心靶点HIF-1α”！
题目：黄芪郁金通过HIF-1α调控肿瘤血管正常化抑制结肠癌转移
英文名：Astragali Radix-Curcumae Rhizoma normalizes tumor blood vessels by HIF-1α to anti-tumor metastasis in colon cancer
杂志：Phytomedicine
影响因子：6.7
发表时间：2025年2月24日
研究背景：肿瘤血管异常通过加剧缺氧微环境、抑制免疫功能等方式促进肿瘤转移。黄芪（补气药）与郁金（活血药）的组合（AC）具有抗肿瘤转移作用，但其调控肿瘤血管正常化的机制尚不明确。
研究思路：通过结肠癌原位移植小鼠模型，结合网络药理学、分子生物学技术（如WB、IF、ELISA等），验证AC通过靶向HIF-1α抑制糖酵解关键酶PFKFB3，增强血管内皮连接，促进血管正常化，最终抑制肿瘤转移。
图1
研究结果：
1、AC对肿瘤负荷小鼠肿瘤生长和肝转移的抑制作用
与模型组（Model）相比，5-Fu组和高剂量AC组（AC-high）的相对生物发光强度显著降低（图2C,D），表明5-Fu和AC-high能有效抑制肿瘤生长。肿瘤体积（图2E-G）和Ki67染色结果进一步支持了这一结论，显示药物干预组的肿瘤增殖率显著降低（图2H,I）。H&E染色显示，模型组的肿瘤组织细胞核密集，而药物干预组的肿瘤细胞分布显示出坏死区域，部分细胞核缺失（图2J）。
图2
2、AC对肿瘤转移的抑制作用
解剖后观察到肝脏上的白色结节，手动计数确定肝转移的数量。结果显示，模型组小鼠的肝脏显示出明显的转移迹象，而5-Fu和AC-high治疗后，肝转移结节的数量显著减少（图3A,B）。H&E染色进一步证实了转移灶核染色的变化（图3C）。WB分析显示，与假手术组相比，模型组中MMP9、N-cadherin和vimentin的表达水平显著升高，而AC给药后这些蛋白的表达水平降低（图3D,E）。
图3
3、AC改善肿瘤血管结构和功能，促进血管正常化
扫描电子显微镜观察结果显示，药物干预后，肿瘤相关内皮细胞（TECs）之间的连接紧密，细胞间间隙减小，形态趋于扁平（图4A）。α-SMA和NG2染色结果表明，AC干预后，血管平滑肌细胞和周细胞的覆盖显著增加。此外，IV型胶原蛋白（Col-IV）的覆盖也显著增强，表明基底膜的支持改善（图4B,C）。如预期，AC干预组中肿瘤血管的lectin阳性染色面积显著增加（图4D,E），且AC干预显著减少了周围血管的dextran渗漏，表明血管通透性降低（图4D,E）。VE-cad在增强内皮细胞连接中起关键作用，qRT-PCR分析显示AC干预后VE-cad表达增加。WB分析进一步评估了VE-cad在细胞膜上的分布，结果显示，与假手术组相比，模型组中细胞膜上的VE-cad表达水平显著降低，而AC给药后VE-cad表达水平相对升高（图4F-H）。
图4
4、 AC通过结合HIF-1α并抑制其核转位来改善缺氧微环境
网络药理学分析表明，AC可能通过改善缺氧微环境来促进肿瘤血管正常化。通过RNA测序数据，研究了AC干预是否能通过改善缺氧微环境来促进肿瘤血管正常化。共鉴定出611个与结直肠癌（CRC）相关的靶点和684个与AC相关的靶点。通过在线工具Venny2.1.0，确定了172个与AC相关的抗CRC靶点（图5a）。这些蛋白的相互作用（PPI）从STRING数据库获得，并在Cytoscape3.7.2中构建了PPI网络（图5B）。基于“degree”值选择了前40个关键靶点，进一步进行KEGG富集分析和“成分-靶点-通路”网络的构建（图5C）。KEGG分析显示，主要信号通路包括PI3K-Akt、FoxO和HIF-1（图5D,E）。基于这些发现，我们重点关注HIF-1α，这是该信号通路的核心靶点。成分-靶点-通路网络表明，AC的主要成分通过这些关键靶点和通路发挥作用，包括槲皮素（A2）和山柰酚（A15）（图5C）。
图5
5、AC的核心成分与HIF-1α的有效结合
将重组HIF-1α蛋白固定在葡聚糖传感器芯片上。基于网络药理学的发现，我们选择了潜在的核心活性成分，如槲皮素和山柰酚，通过表面等离子共振（SPR）常数探索它们与HIF-1α的直接相互作用和亲和力。结果显示，槲皮素和山柰酚可以与HIF-1α直接结合，KD值分别为4.04×10⁶和3.39×10⁵（图5F）。
6、AC调节HIF-1α的表达并抑制其核转位，抑制糖酵解
HIF-1α仅在缺氧条件下稳定表达，允许其转位到细胞核并调节多种基因的转录。首先，我们对肿瘤组织中的HIF-1α进行IF染色，以评估各组肿瘤缺氧的程度。结果显示，药物干预减少了肿瘤组织中HIF-1α阳性区域的面积，改善了肿瘤的氧合（图6A,B）。qRT-PCR和WB分析进一步证实了这些发现（图6C,E,H）。进一步检查肿瘤组织中HIF-1α蛋白的核表达，结果显示，与假手术组相比，模型组中HIF-1α的表达水平显著升高，而AC给药后HIF-1α的核表达水平降低（图6C,E,H）。HIF-1α诱导多种代谢转化酶，使肿瘤代谢转向糖酵解。PFK-1是糖酵解的主要限速酶，由PFKFB产生的果糖-2,6-二磷酸激活，从而促进糖酵解。我们的结果显示，与假手术组相比，模型组中PFKFB3异常过表达，而药物干预后其表达水平显著下调（图6D,E,G）。我们测量了果糖-1,6-二磷酸水平，发现AC-high处理后该水平降低（图6H）。乳酸的产生是肿瘤细胞糖酵解率的主要指标。我们的研究发现，AC干预组的血清乳酸水平显著低于模型组（图6I）。
图6
7、AC通过HIF-1α改善缺氧微环境，延缓肿瘤进展
首先通过腹腔注射HIF-1α稳定剂DMOG来建立有效稳定和积累HIF-1α的小鼠模型。为了评估DMOG的效果，我们对各组小鼠肿瘤组织中的HIF-1α进行了IF染色。结果显示，与模型组相比，DMOG处理组中HIF-1α的阳性表达显著增加。此外，AC和DMOG联合干预后，HIF-1α的阳性率显著降低（图7H,I）。WB分析进一步证实了这些发现（图7J,K）。我们进一步研究了HIF-1α过表达对小鼠肿瘤生长和转移的影响，并比较了AC干预的效果。与模型组相比，DMOG刺激后肿瘤体积和重量增加。此外，在AC和DMOG联合组中，肿瘤体积和重量相较于DMOG单独组有所减少（图7C,D）。H&E染色显示，与DMOG单独组相比，AC和DMOG联合组的肿瘤细胞核排列稀疏，显示出明显的肿瘤坏死区域和细胞核缺失（图7E）。Ki67IHC染色的结果与这些发现一致（图7F,G）。
图7
8、AC抑制缺氧诱导的肝转移
与模型组相比，DMOG刺激后的肿瘤显示出更强的肝转移能力，而AC治疗抑制了缺氧诱导的肝转移（图8A,B）。H&E染色证实了这些发现（图8C），表明DMOG处理后肿瘤的肝转移增加。相反，在AC和DMOG联合干预组中，肝转移相较于DMOG单独组有所减少。
图8
9、AC通过HIF-1α促进肿瘤血管正常化并改善缺氧微环境
AC可能通过调节HIF-1α来影响肿瘤血管的结构和功能，从而抑制肿瘤转移。与模型组相比，DMOG刺激后，血管平滑肌细胞标记物αSMA、周细胞标记物NG2和基底膜标记物Col-IV的水平显著降低。此外，与DMOG单独组相比，AC和DMOG联合治疗组中血管平滑肌细胞、周细胞和基底膜的覆盖显著增强（图9A,B）。dextran渗漏实验结果显示，与模型组相比，DMOG建模后dextran外渗面积增加。重要的是，AC似乎恢复了HIF-1α过表达小鼠的血管通透性，从而抑制了渗漏（图9C,D）。此外，lectin灌注结果显示，与DMOG单独组相比，AC和DMOG联合组中lectin阳性信号面积增加，表明AC逆转了HIF-1α过表达的影响，并改善了这些小鼠的血液灌注（图9C,D）。
图9
10、AC通过HIF-1α抑制糖酵解，促进肿瘤血管正常化
AC可能通过调节HIF-1α和抑制糖酵解来影响肿瘤血管的重塑。观察结果显示，AC和DMOG联合组中PFKFB3的表达显著低于DMOG单独组（图9E-G）。此外，与DMOG单独组相比，AC和DMOG联合组中VE-cadherin的表达增加（图9E,G）。我们还注意到，HIF-1α的表达增加伴随着果糖-6-二磷酸浓度的相应增加。值得注意的是，AC降低了果糖-6-二磷酸浓度，AC和DMOG联合组相较于DMOG单独组果糖-6-二磷酸浓度显著降低（图9H）。
总结：本研究发现AC通过抑制HIF-1α核转位，下调PFKFB3减少糖酵解，增强血管内皮连接蛋白VE-cad表达，促进肿瘤血管结构功能正常化，改善缺氧微环境，抑制结肠癌生长与肝转移。傲星生物深耕生信分析十余载，有丰富的实验方案、完善的下游验证、机制研究服务，一对一专属服务为您排忧解难，助您轻松应对毕业和晋升！
