题目：探索葛根在肥胖调节中的作用

英文名：Exploring the mechanism of Pueraria lobata (Willd.) Ohwi in the regulation of obesity

杂志：Journal Of Ethnopharmacology

影响因子：4.8/Q1

发表时间：2024年8月16日

研究背景：葛根（PR）富含黄酮类、三萜类、皂苷、多糖等化学成分。肥胖和各种慢性疾病不仅对人们的健康构成巨大威胁，而且给人们带来沉重的经济负担和医疗投入。目前研究表明，葛根具有降低血糖、改善胰岛素敏感性和抑制肥胖的作用。然而，葛根抑制肥胖的具体机制尚不清楚，通过网络药理学和实验相结合来研究葛根抗肥胖作用的研究较少。

研究思路：本研究采用网络药理学技术研究PR的治疗效果和作用机制。通过相关数据库，共筛选出6种主要化学成分和257个潜在靶点。蛋白质相互作用分析表明，AIfT1、AKR1B1、PPARG、MMP9、TNF、TP53、BAD和BCL2是核心靶点。富集分析表明，PR在预防肥胖方面的作用途径涉及癌症信号通路和PI3K-Akt信号通路，它们可能是主要的作用途径。进一步的分子对接验证表明，其核心目标物与4种化合物具有良好的结合活性：formononectin、purerin、7,8,4,-trihydroxide和大豆黄素。利用超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）技术检测并确认了这些主要化合物。细胞实验结果表明，葛根素以浓度依赖性方式抑制细胞增殖和分化，显著促进细胞凋亡并影响细胞迁移。动物实验表明，葛根素能减少小鼠的食物摄入量和体重增加。研究发现，葛根素能上调高密度脂蛋白（HDL），下调总胆固醇（TC）、总胆固醇（TG）和低密度脂蛋白（LDL）等血液生化指标。Western印迹结果表明，葛根素能显著抑制AKT1、AKR1B1、MMP9、TNF、TP53、BCL2、PPARG ，并在细胞和动物水平上显著增加BAD蛋白的表达。

图1

研究结果：

1、PR活性成分的筛选和靶点信息分析

通过TCMSP数据库搜索 PR 的有效成分和相应的关键靶点信息。筛选出6种活性化合物：谷氨酰葡萄糖、甲醛素、β-谷甾醇、3'-甲氧基黄苷元、purerin和7,8,4'-三氢氧化物异黄酮。

2、预测潜在作用靶点，构建抗肥胖PR有效成分靶点网络

通过SwissTarget预测平台，得到了431个作用靶点。从GeneCards等数据库中共检索并整合了1521个肥胖症靶点。PR的活性成分和肥胖症共有靶点257个（图2A）。利用Cytoscape3.7.2软件进行可视化，然后得到PR、有效成分和目标的网络图（图2B）。

图2

3、PPI网络构建和分析

将257个常见靶标上传到STRING，并使用Cytoscape3.7.2软件对靶标蛋白进行分析，得到PPI（图2C）。其中有8个靶标超过了平均度值，推测这8个靶点是肥胖症PR的主要靶点。从这8个靶点可以看出，许多物质，如转录因子、信号分子、受体、蛋白质（转运载体蛋白）和酶（激酶、转移酶、蛋白酶）都参与了肥胖症的预防和治疗。其中，AItT1、AItR1B1、PPARG、MMP9、TNF、TP53、BAD和BCL2的节点度值排名前8位。这些靶点可能是肥胖症治疗的主要靶点。然后使用Cytoscape3.7.2软件对核心靶蛋白进行分析，得到前8个蛋白的PPI网络（图2D）。

4、GO和KEGG富集分析

GO富集分析结果表明，BP主要参与PR的抗肥胖靶标，包括信号转导、G蛋白偶联受体信号通路、RNA聚合酶II启动子转录正调控等。CC主要分布在质膜、细胞质、胞浆等部位。CC主要参与蛋白质结合、ATP结合、同种蛋白结合等（图3A）。

KEGG通路分析的结果表明，PR 治疗肥胖的靶点主要集中在癌症中的通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、前列腺癌、氮代谢、脂质和动脉粥样硬化、雌激素信号通路、内分泌抵抗等通路（图3B），一些关键靶基因分别与肿瘤信号通路（图3C）和PI3K-AKT信号通路（图3D）相关，并覆盖在肥胖的调控中。

图3

5、分子对接验证结果

图4显示了6个化合物与肥胖症核心靶标的分子对接模式。对接结果显示，purerin 与 AKT1 蛋白的氨基酸残基 ARG-25 、 SER-56 和 GLU-9 形成氢键 （图4A）；Daidzein与BAD蛋白的氨基酸残基ARG-55、SER-22和SER-29形成氢键（图4B）；ALA-113和BAD蛋白的SER-47形成氢键（图4C）；Purerin与BAD蛋白的氨基酸残基SER-22和ASN-162形成氢键（图4D）；Daidzein与AItR1BI蛋白形成疏水作用（图4E）；Formononetin与BAD蛋白的氨基酸残基GLN-183形成氢键（图4F）。7,8,4′-疏水性异黄酮与AKR1B1蛋白相互作用（图4G）;Purerin与AKR1B1蛋白的氨基酸残基PRO-261和GLU-271形成氢键（图4H）;黄豆苷元和BCL-2蛋白之间形成疏水相互作用（图4I）;Purerin与BCL-2蛋白HIS-143、GLU-113和SER-49的氨基酸残基形成氢键（图4J）;Purerin与TP53蛋白的氨基酸残基LYS-51、ASN-37和SER-18形成氢键（图4K）;Formononetin与MMP-9蛋白的氨基酸残基SER-32形成氢键（图4L）;葛根素与MMP-9蛋白的氨基酸残基ARG-17和ARG-22形成氢键（图4M）;黄豆苷元与PPARG蛋白的氨基酸残基GLU-343形成氢键（图4N）;7,8,4′-三羟基异黄酮与PPARG蛋白的GLY-346和ARG-280形成氢键（图4O）;Purerin与PPARG蛋白的氨基酸残基SER-342、GLU-343和PHE-282形成氢键（图4P）;黄豆苷元和TNF蛋白之间的疏水相互作用（图4Q）;Formononetin与TNF蛋白形成疏水相互作用（图4R）;葛根素和TNF蛋白形成疏水相互作用（图4S）。

图4

基于PPI网络，选择了度数前8名的核心靶基因与葛根素进行分子对接。TNF的LibDock评分为108.676（图5a），AKT1的LibDock评分为106.146（图5B），AKR1B1的评分为93.0223（图5C），BAD的评分为79.2118（图5D），BCL2的评分为78.982（图5E），MMP9的评分为105.4866（图5F），PPARG的评分为79.2118（图5 F）G）的对接评分为109.9212，与TP53结合的LibDock评分为106.189（图5H），葛根素与肥胖相关靶点的结合相对较好。

图5

6、¹H-NMR,¹³C-NMR,UPLC-MS和GC-MS结果

图中显示了正离子模式（图6A）和负离子模式（图6B）下 PR 样品的典型总离子色谱图。共有37种化合物。通过分析UPLC-MS和GC-MS数据，确定了上述源自 PR 的6个成分。

图6

7、基于3T3-L1脂肪细胞的体外实验验证结果

7.1、葛根素对3T3-LI细胞活力的影响

图7A显示了4种活性PR化合物的二维结构图。图7B为PP中LibDock得分highest的化合物（葛根素）的三维结构图。为了研究葛根素对3T3-LI细胞活性的影响，本研究比较了加入或不加入不同浓度的葛根素（50、100、200、400、800和1000mg/L）和不同浓度的奥利司他阳性药物（50和100mg/L）后的对照组。发现葛根素以剂量依赖的方式降低了3T3-LI前脂肪细胞的活性，这与阳性药物的趋势一致（图7C）。

图7

7.2、葛根素对3T3-LI前脂肪细胞划痕生长率的影

为探讨葛根素对3T3-LI细胞迁移率的影响，通过细胞划痕水平验证葛根素对细胞划痕愈合程度的影响，并对干预后12、24h分别添加或不添加不同浓度葛根素（50、100、200mgJL）和50mg/L奥利司他阳性药物的划痕伤口愈合程度进行统计（图8）。药物治疗12h后，葛根素50、100和200mgJL治疗组的划痕愈合率分别为34.82%、33.88%和26.93%，阳性药物组的划痕愈合率为24.47%。24小时后，50、100和200mgJL治疗组葛根素的划痕愈合率分别为66.23%、58.74%和51.63%，阳性药物组的划痕愈合率为56.31%。结果表明，葛根素对细胞迁移有一定的抑制作用，其剂量依赖性与阳性药物组相同。

图8

7.3、葛根素对3T3-LI前脂肪细胞的细胞凋亡结果

通过检测葛根素对细胞凋亡的影响，验证了葛根素对3T3-LI细胞活力的影响（图9）。与对照组相比，不同浓度（50、100和200mg/L）的葛根素和50mg/L奥利司他阳性药物的细胞凋亡率分别为12.31%、14.30%和19.00%。随着剂量的增加，葛根素对细胞凋亡的促进作用相同，且促进细胞凋亡的趋势呈上升趋势，说明葛根素能促进细胞凋亡。

图9

7.4、葛根素对3T3-LI前脂肪细胞的油红O染色结果

为了确定葛根素是否具有抑制成脂分化的作用，本研究对添加或不添加不同浓度（50、100、200mgJL）葛根素的细胞进行了油红O染色，并设立了药物干预阳性组。与完全分化的脂肪细胞相比，葛根素剂量依赖性地抑制了3T3-LI细胞在第3、6和9天的脂滴生成（图10）。第9天的抑制效果更明显，且抑制效果优于阳性药物。因此，葛根素可减少3T3-LI细胞脂肪分化过程中的脂质积累。

图10

7.5、葛根素对相关蛋白表达量的影响

与对照组相比，模型组AKR1B1（图11A）、AKT1（图11B）、BCL2（图11C）、MMP9（图11D）、PPARG（图11E）、TNF（图11F）和TP53（图11G）蛋白的表达水平显著升高（P<0.05），而BAD的表达水平（图11H）蛋白显著降低（P <0.05）。与模型组相比，给药组AKT1、AKR1B1、PPARG、MMP9、TNF、TP53和BCL2蛋白表达水平显著降低（P <0.05），而BAD蛋白表达水平显著升高（P <0.05）。

图11

8、体内食物摄入量和体重的结果

在研究结束时（第9周），与其他组相比，实验组之间的食物摄入量有所减少，如图 12B.NC：第1周20.849，第9周26.065，增加25.02%HFD：第1周20.609，第9周36.134，增加75.33%PUE：第1周20.456，第9周27.166，增加32.80%ORL：第1周20.905，第9周31.647，增加51.38%。所有小鼠的体重变化如图 12A所示。NC组小鼠体重增加了25.02%，而高脂饮食喂养的动物体重增加了75.33%，显著高于NC组。然而，PUE组小鼠的体重仅比初始体重增加了32.80%，显著低于HFD组。这表明PUE干预可以降低体重增加的速度。

图12

9、体内苏木精和伊红染色结果

分别对脂肪组织和肝组织进行了苏木精和伊红（H&E）染色。脂肪组织的染色结果表明，补充葛根素可以缩小脂肪细胞的体积。图12D显示，葛根素处理组小鼠的细胞体积与对照组相同，而高脂饮食组小鼠的细胞体积均与对照组相同。此外，葛根素处理还减少了大中型脂肪细胞的数量。同时，肝脏的H&E染色（图12C）显示，喂食高脂饮食的小鼠肝脏中有脂滴，而葛根素能有效缓解酒精和高脂饮食诱导的脂质积累。H&E染色显示肝组织结构严重异常，空泡化严重。肝脏组织中一些肝细胞排列稀疏，少数肝细胞水肿。一些炎性细胞也有浸润。PUE干预后，这些症状明显缓解。

10、体内生化分析结果

体内生化分析结果如图 12E所示，HFD组血清甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平显著高于NC组。与HFD组相比，PUE组血脂水平显著降低。从血清总甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、总胆固醇（TC）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）4项血脂指标观察葛根素的调节功能，差异显著，呈改善趋势。

11、体内Western印迹检测结果

Westernblot结果显示，如图13 所示，与NC组相比，HFD显著上调PPARG、BCL2、TNF、AKT、TP53、MMP9、AKR1B1，显著下调BAD。与HFD组相比，PUE组显著改善PPARG、BCL2、TNF、AKT、TP53、MMP9、AKR1B1的上调和BAD的下调。

图13

总结：本研究采用网络药理学+分析对接的方法，预测了其有效成分及其治疗肥胖症的作用机制，为进一步研究提供了理论依据！傲星生物有丰富的分析方案、完善的下游验证、机制研究服务，一对一专属服务为您排忧解难，助您轻松应对毕业和晋升！