生信分析+实验验证，力斩11分佳作，可复现性强！！！

题目：利用网络药理学发现治疗增生性疤痕的潜在药物

英文名：Using network pharmacology to discover potential drugs for hypertrophic scars

杂志：The British journal of dermatology

影响因子：11

发表时间：2024年5月

研究背景：外伤、手术、烧伤和蚊虫叮咬都会造成皮肤损伤，并可能导致被称为“增生性”疤痕的厚而隆起的疤痕。肥厚性瘢痕是一种因成纤维细胞过度增殖而导致皮肤异常纤维化的疾病。现有药物的治疗效果并不理想。探索增生性疤痕的分子发病机制，筛选治疗增生性疤痕的有效药物具有重要意义。

研究思路：利用数据库现有的人肥厚性瘢痕RNA测序数据，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）寻找与肥厚性瘢痕相关的基因模块和关键基因。在化合物库中筛选候选化合物。通过分子对接筛选潜在药物，并在人类肥厚性瘢痕成纤维细胞和小鼠机械力增生性瘢痕模型中进行验证。

研究结果：

1、WGCAN分析揭示了肥厚性瘢痕中的重要基因模块

通过对10个增生性疤痕样本和5个正常疤痕样本进行WGCNA分析，我们发现增生性疤痕中有6个重要的基因模块（图1a、b）。黑色模块（n=648个基因；P=0.04，GS=0.53）与增生性瘢痕呈正相关，而青色模块（n=361个基因；P=0.00004，GS=-0.86）、蓝色模块（n=3764个基因；P=0.003，GS=-0.86）、黑色模块（n=648个基因；P=0.04，GS=0.53）与增生性瘢痕呈负相关、GS=-0.7）、royal蓝（n=134个基因；P=0.006，GS=-0.67）、绿松石色（n=1758个基因；P=0.009，GS=-0.65）和淡青色模块（n=481个基因；P=0.01，GS=-0.63）与增生性瘢痕呈负相关（图1c）。GO和KEGG富集分析揭示了不同模块中基因的功能。在黑色模块中，基因与粘连接头和能量代谢有关。青色模块与肌动蛋白细胞骨架调节、Ras信号通路和细胞因子受体活性有关。蓝色模块与病灶粘附、紧密连接、ECM受体相互作用、Rap1信号通路和细胞骨架的结构成分有关。在royal蓝模块中，基因与钙信号途径、Wnt信号途径和皮肤表皮的结构成分有关。绿松石色模块显示与细胞代谢和TGF-β信号通路有关，而淡青色模块则与过氧物酶体和氧化酶有关（图1d）。

图1

2、连接图数据库和分子对接筛选出治疗肥厚性瘢痕的潜在药物

如上所述，对发现的6个重要模块中意义highest的300个基因进行PPI分析。结果表明，ITGB1是枢纽蛋白（图2a）。整合素是一种跨膜蛋白，与细胞内的应力纤维和周围的ECM相关。以往的研究表明了整合素在纤维化中的重要作用，它能响应机械张力信号并介导TGF-β功能。

利用CMAP数据库对这300个基因进行分析，筛选出最重要的50种候选药物。对50种候选药物和ITGB1进行了蛋白质-分子对接计算。9种对接能量较低的药物被选为治疗肥厚性瘢痕的潜在药物：恩扎司他林（-7.7kcal/mol）、SU11274（-7.5kcal/mol）、林西替尼（-7.5kcal/mol）、索拉非尼（-7.5kcal/mol）、伊马替尼（-7.4kcal/mol）、克唑替尼（-7.1kcal/mol）、莫美罗替尼（-7.1kcal/mol）、TAS-301（-7kcal/mol）和他克莫司（-7kcal/mol）（图2b）。

对这九种候选化合物进行了qPCR实验。用每种化合物10μmol/L培养人皮肤成纤维细胞1、3和7天。结果显示，第1天，ITGB1的表达减少，第3天，TGF-β1的表达减少，第7天，COL1A1、DCN和TGF-β1的表达减少（图2c）。其他六个化合物处理组的基因表达未见明显变化。因此，克唑替尼、索拉非尼和SU11274被选为治疗增生性瘢痕的潜在药物。

图2

3、克唑替尼、索拉非尼和SU11274可降低增生性瘢痕成纤维细胞在体外的迁移能力

为了研究三种候选药物对人皮肤成纤维细胞迁移的抑制作用，使用1、5和10μmol/L的克唑替尼、索拉非尼和SU11274进行了伤口愈合实验。药物处理与伤口面积之间存在明显的相关性。剂量依赖性与对照组相比，三种药物处理组（1-10μmol/L）在24、48和72小时内的伤口愈合速度都有所下降，这表明三种候选药物都能显著降低人皮肤成纤维细胞的迁移能力（图3）。

图3

4、克唑替尼、索拉非尼和SU11274可抑制肥厚性瘢痕成纤维细胞增殖并下调纤维化相关蛋白

抑制成纤维细胞增殖可以缓解瘢痕肥大。因此，作者研究了克唑替尼、索拉非尼和SU11274能否抑制人皮肤成纤维细胞在体外的过度增殖。结果显示，药物治疗明显影响了人皮肤成纤维细胞的增殖：1μmol/L的克唑替尼、索拉非尼和SU11274对抑制HSF增殖无效，但在5μmol/L和10μmol/L的浓度下，增殖受到明显抑制。还对正常成纤维细胞的增殖指数进行了评估，发现其增殖指数低于HSF。用10μmol克唑替尼和SU11274处理将人皮肤成纤维细胞的增殖指数降低到与正常成纤维细胞相似的水平（图4a）。

用10μmol克唑替尼、索拉非尼和SU11274处理人皮肤成纤维细胞3天后，对其进行了Western印迹检测。结果表明，克唑替尼能显著降低α-SMA、COL1A1、ITGB1和TGF-β的表达。索拉非尼和SU11274也能明显降低α-SMA和COL1A1的水平，但不能降低ITGB1或TGF-β的水平（图4b）。

图4

5、克唑替尼和整合素β1小干扰RNA可减轻小鼠肥厚性瘢痕的形成

根据已公布的手术方案，建立了小鼠增生性疤痕模型；小鼠皮下注射三种候选药物。使用ITGB1 siRNA 验证ITGB1的枢纽功能。比较实验组和对照组小鼠的疤痕总面积。接受克唑替尼、索拉非尼、SU11274 和 ITGB1 siRNA治疗的小鼠的疤痕面积均显著减少。然而，克唑替尼的抑制作用（图5a）。疤痕隆起通过血红素和伊红染色进行评估。疤痕隆起指数定义为 “D/d ”比值，“D”代表疤痕的厚度，“d”代表邻近正常皮肤的厚度。结果表明，与对照组相比，使用克唑替尼、索拉非尼、SU11274和ITGB1 siRNA治疗的小鼠的瘢痕增生指数均显著降低。此外，克唑替尼对瘢痕增生的抑制能力明显高于索拉非尼和 SU11274，索拉非尼和 SU11274 对瘢痕增生的抑制效果无明显差异（图 5b）。此外，还使用马森三色染色法测定了瘢痕横截面积的变化。与对照组相比，接受克唑替尼、索拉非尼、SU11274 和 ITGB1 siRNA 治疗的小鼠的横截面瘢痕面积明显缩小。克唑替尼治疗组的瘢痕横截面积也小于索拉非尼和 SU11274 治疗组，索拉非尼和 SU11274 治疗组之间没有明显差异（图 5c）。研究结果表明，与索拉非尼和 SU11274 相比，克唑替尼对抑制疤痕形成的效果最好。研究还表明，ITGB1 siRNA 可减轻小鼠瘢痕的形成。

图5

6、靶点预测表明，克唑替尼可影响肥厚性瘢痕信号通路

利用DrugBank和SwissTargetPrediction数据库，预测了克唑替尼的100个药理靶点，每个靶点的概率都超过了0.9；在肥厚性瘢痕的6个重要模块中发现了36个基因：黑色模块中有7个目标，青色模块中有1个目标，蓝色模块中有20个目标，royal蓝色模块中有2个目标，绿松石模块中有6个目标。

GO分析表明，克唑替尼的药理靶点与跨膜受体蛋白激酶活性、生长因子结合、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）活性、支架蛋白结合有关、表皮生长因子（EGF）受体（EGFR）结合、整合素结合和肌动蛋白单体结合（图6a）。KEGG分析表明，药理靶点与MAPK信号通路、磷酸肌酸3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路、Ras信号通路、粘连接头、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂抗性、局灶性粘连、肌动蛋白单体结合（图6a）有关、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂抗性、病灶粘附、肌动蛋白细胞骨架调节、TGF-β信号通路和Janus激酶（JAK）/信号转导和转录激活因子（STAT）信号通路（图6b）。克唑替尼的药理靶点包括TGF-β、integ-rin结合和其他经典的肥厚性瘢痕相关信号通路；因此，克唑替尼可能是一种有效的抗肥厚性瘢痕药物。

图6

总结：本文通过WCGNA、PPI、分子对接和药物数据库分析方法，筛选出增生性瘢痕的高相关性基因以及潜在的治疗药物，并在体外做了验证。思路常规，非常容易复现，生信越来越成为低成本探索科学问题的工具！傲星生物提供多种高阶生信分析方案，另有完善的下游验证、机制研究服务，一对一专属服务为您排忧解难，助您轻松应对毕业和晋升！