Q1区7.7分，国自然热点研究案例：网络毒理学+分析对接+乳酸化+实验机制解析！！！

题目：低水平暴露于BDE-47会通过TOP2A/LDHA/乳酸化正反馈回路促进前列腺癌的发展

英文名：Low level exposure to BDE-47 facilitates the development of prostate cancer through TOP2A/LDHA/lactylation positive feedback circuit

杂志：Environmental Research

影响因子：7.7

发表时间：2024年10月

研究背景：2,2′，4,4′-四溴化二苯醚（BDE-47）是一种阻燃剂，有半挥发性、高毒性、生物累积性，是一种有机污染物（POPs）。虽然BDE-47与激素依赖性癌症（如乳腺癌）的关系已得到证实，但之前的研究并未考察BDE-47暴露是否与前列腺癌（PCa）的发生有关。本研究旨在通过大量和单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析以及体外和体内实验，研究BDE-47暴露对PCa进展的影响。

研究思路：基于比较毒物基因组学数据库（CTD）和癌症基因组图谱（TCGA），通过筛选和重叠获得了34个BDE-47相关基因和PCa相关基因。这些基因明显富集在脂肪酸代谢相关的GO通路中，从UniProt获得的BDE-47靶向基因中也在这些术语富集。通过scRNA-seq数据，在男性PCa组织中观察到CYP2E1、PIK3R1、FGF2和TOP2A有一定的细胞类型特异性表达。分子对接模拟显示，BDE-47与AOXI、PIK3R1、FGF2、CAV2、CYP2E1和TOP2A的蛋白残基紧密结合。根据患者总生存率、接收者操作特征曲线（ROC）和格里森评分分级系统进行进一步筛选后，候选基因的范围缩小到了TOP2A。从机理上讲，TOP2A抑制剂可以逆转BDE-47对PCa细胞的生长促进作用。随后的RNA-seq实验表明，TOP2A通过上调LDHA和糖酵解促进了PCa的进展。此外，乳酸通过乳化PCa细胞中的H3K18la上调了TOP2A的转录，而LDHA的敲除可以挽救这种情况。综上所述，低剂量BDE-47通过TOP2A/LDHA/乳酸化正反馈回路触发PCa进展，从而揭示了BDE-47诱导前列腺癌发生的表观遗传学转变和代谢重编程的基础。

研究结果：

1、低剂量BDE-47可诱发体外和体内PCa的进展

首先，应用CCK-8试验评估BDE-47对细胞的毒性。PCa细胞（PC3和LNCaP）暴露于BDE-47（0-10pM）。给予BDE-47后，分别在4、8、12或24小时后评估细胞存活率。结果表明，BDE-47的浓度为0、0.01、0.1或1pM时，细胞活力均无明显变化。另一方面，当浓度为10pM时，PCa细胞的活力开始显著下降。考虑到BDE-47的细胞毒性和人体暴露情况，选择了低剂量（0.01和0.1qM）进行进一步实验，探讨了低剂量（0.01和0.1qM）BDE-47对PC3和LNCaP细胞生长的影响。一系列体外实验表明，低剂量BDE-47以剂量依赖的方式促进了PC3和LNCaP细胞的增殖（图1A-C）、迁移（图1D-G）和侵袭（图1H-I）。随后，还在体内研究了低剂量BDE-47对PCa细胞的影响。发现，与对照组相比，BDE-47组的肿瘤重量呈明显的剂量依赖性增加趋势（图1J-K）。此外，还通过H&E染色对肿瘤组织学进行了评估。在所有三个组中，发现在肿瘤组织中，细胞核与细胞质的比率无一例外地相对较高。与对照组的肿瘤组织形态相比，BDE-47组中检测到更多的空泡和核染色过深的细胞（图IL）。上皮细胞向间充质转化（EMT）是癌症进展过程中的一个关键事件。上皮和间质标记是EMT的标志，对小鼠肿瘤组织的IHC染色显示，间质标记物（N-cadherin和波形蛋白）的表达水平与BDE-47剂量呈正相关（图1L-M）。相反，检测到上皮标志物（E-cadherin）的表达水平与BDE-47剂量呈负相关（图1L-M）。这可以解释为BDE-47会引发PCa细胞在体内的进展。

图1

2、PCa相关基因和BDE-47相关基因的鉴定和富集

基于TCGA的正常前列腺和PCa组织样本，进行了差异基因表达分析，得到了正常前列腺和PCa样本之间的2983个DEGs。在这些DEGs中，1270个上调，1713个下调（图2A）。然后将这些DEGs与CTD数据库中的BDE-47相关基因和PCa相关基因进行交叉，结果发现了34个重叠基因（图2B）。根据这些重叠基因，进行了GO和KEGG注释（图2C-D）。GO富集的结果包括脂肪酸代谢、激素分解代谢过程、对氧化应激的响应等通路（图2C），KEGG通路包括类固醇激素合成和许多化疗药抗性相关通路（图2D-E）。此外，有29个重叠基因被用于构建PPI网络，该网络包含140条边（图2F）。在这29个重叠基因中，UGT2B15、MMP9、FOLH1、EPCAM、HSD17B3、TOP2A、GDF15、AMACR和GNMT上调，而其他20个基因下调（图2F）

图2

3、筛选PCa的预后相关基因和诊断相关基因

为了探讨PCa组织中基因表达与总生存率的相关性，从TCGA中提取了重叠基因的mRNA水平和PRAD病例的临床信息。结果发现，12个重叠基因在低表达和高表达的PCa病例之间的总生存率存在显著差异，包括AOX1（图3A）、CAV2（图3B）、CYP2E1(图3C）、FGF2（图3D）、LRP1B（图3E）、GJA1（图3F）、LPL（图3G）、HSD17B3（图3H）、TOP2A（图3I）、MET（图3J）、PIK3R1（图3K）和SULTIEl（图3L）。

图3

根据TCGA和GTEx数据库中的正常前列腺和PCa样本，利用ROC曲线进一步评估了各重叠基因在PCa中的诊断价值。结果显示，AOX1（图4A）、FGF2（图4B）、CAV2（图4C）、CYP2E1（图4D）、TOP2A（图4E）、LRPIB（图4F）和PIK3R1（图4G）等7个基因的AUC均超过0.8，具有很好或突出的诊断价值。

图4

4、分子对接和药物靶点分析

为了预测BDE-47的结合位点和蛋白质结构，进行了分子对接。经过这一筛选步骤后，还剩下6个基因。对接结果显示，AOX1、PIK3R1、FGF2、CAV2、CYP2E1和TOP2A的对接得分相对较高，BDE-47通过H键与这些蛋白残基紧密结合（图5a-F）。此外，还通过UniProt数据库获得了BDE-47的277个靶基因，并进行了GO术语富集，富集结果主要包括脂肪酸β-氧化、脂肪酰-CoA结合和其他脂肪酸代谢相关通路（图5G），这意味着BDE-47可能在很大程度上影响了PCa的脂肪酸代谢。

图5

5、前列腺不同细胞类型中基因的表达分布

为了探索其余6个基因在前列腺内不同细胞类型中的表达分布，通过分析scRNA-seq数据，注释了前列腺组织样本中的11种细胞类型（图6A），每个marker基因都表现出相应细胞类型特异性的高表达（图6B）。正常前列腺组织样本和PCa组织样本的整体基因表达分布存在明显差异（图6C）。在不同细胞类型中，基底上皮（BE）和管腔上皮（LE）的细胞数量比例highest（图6D）。与正常前列腺样本相比，PCa样本中LE的细胞数比例较高，而BE的细胞数比例较低（图6E）。此外，还研究了其余6个基因在正常前列腺样本和PCa样本中的表达分布，观察发现，CYP2E1在正常前列腺和PCa样本中具有高度特异性表达（图6F）。

图6

6、低剂量BDE-47通过上调TOP2A促进PCa的进展

为了研究基因表达水平与PCa组织Gleason评分的相关性，比较了18例Gleason评分为≤6的PCa样本和47例Gleason评分为≥7的PCa样本中其余6个基因的表达水平。TOP2A在Gleason评分为≥7的PCa样本中的表达水平明显高于Gleason评分为≤6的样本（图7A）。相比之下，其他5个基因的表达水平在Gleason评分≥7分的PCa样本和Gleason评分≤6分的PCa样本中没有明显差异。此外，在PC3和LNCaP细胞中检测到的TOP2A蛋白水平明显高于WPMY-1细胞（图7B）。为了研究TOP2A表达对PCa细胞进展的影响，用低剂量（0.01pM）BDE-47处理PC3或LNCaP细胞，同时使用/不使用TOP2A抑制剂ICRF-193。事实证明，低剂量BDE-47能上调PC3和LNCaP细胞的增殖，而TOP2A抑制剂ICRF-193则能挽救这种增殖（图7C-E）。同样，研究发现低剂量BDE-47可促进PC3和LNCaP细胞的迁移能力（图7F-I）和侵袭能力（图7J和K），ICRF-193可缓解这种情况（图7F-K）。

图7

7、TOP2A可通过上调LDHA和糖酵解

为了研究TOP2A引发PCa进展的分子机制，分别将TOP2A siRNA转染到PC3和LNCaP细胞中（图8A）。对转染了TOP2A siRNA的PC3细胞进行了RNA-Seq测序，富集分析显示，TOP2A基因敲除对丙酮酸代谢、氧化磷酸化和癌症中枢碳代谢有显著影响（图8B）。值得注意的是，丙酮酸代谢具有highest的富集指数（图8B）。在丙酮酸代谢通路中的DEGs中，AKR1A1、ACOT12、LDHA、LDHC和ALDH7A1在TOP2A敲除后均表现出显著且相似的下调（图8C）。用qPCR验证了TOP2A敲除对PCa细胞中AKRIAI、ACOT12、LDHA、LDHC和ALDH7A1mRNA水平的影响。结果发现，TOP2A敲除后，PC3和LNCaP细胞中AKR1A1和LDHA的mRNA水平同时下调（图8D）。此外，WB分析表明，TOP2A基因敲除后，PC3和LNCaP细胞中LDHA同时下调，而AIfR1A1没有下调（图8D-E)。此外，来自TCGA的转录组数据进一步证实了这一正向相关性。在PCa患者中，TOP2A和LDHA的mRNA水平之间存在差异（图8F）。此外，低剂量（0.01uM）BDE-47可上调PC3细胞中LDHA的蛋白水平，而TOP2A基因敲除可挽救LDHA的蛋白水平（图8G）。此外，TOP2A过表达也会上调PC3细胞中LDHA的蛋白水平（图8G）。此外，还发现敲除TOP2A会降低LDH活性（图8H）、葡萄糖摄取量（图8I）和乳酸浓度（图8J），这意味着敲除TOP2A对PCa细胞的糖酵解有抑制作用。

图8

接下来研究了TOP2A和LDHA的表达对PCa进展的影响。具体而言，体外实验表明，TOP2A敲除抑制了PC3和LNCaP细胞的增殖（图9A-C）、迁移（图9D-G）和侵袭（图9H和I）能力，而LDHA的过表达则可以挽救这些能力（图9A-I）。

图9

8、乳酸盐通过H3K18的乳化作用促进TOP2A的转录

为了评估PCa细胞的组蛋白乳化情况，用一系列浓度的LA处理PC3细胞。结果显示，用LA处理后，PC3细胞中TOP2A、总乳化（Pan-Kla）和组蛋白乳化（H3K18la）的蛋白水平呈剂量依赖性上调（图10A）。此外，LDHA基因敲除会降低TOP2A、Pan-Kla和H3K18la的蛋白水平，而LA处理可以挽救这些蛋白水平（图10B）。考虑到组蛋白乳化会调控基因转录，研究了组蛋白乳化是否会影响TOP2A的转录。结果发现，LDHA敲除抑制了PC3细胞中H3K18与TOP2A启动子的结合活性，而用LA处理后这一效应被挽救（图10C）。此外，LDHA敲除会降低TOP2A的mRNA水平，LA处理后可逆转（图10D）。这些结果表明，LDHA或乳酸可通过组蛋白乳酸化上调TOP2A的转录。此外，研究还发现低剂量BDE-47可通过上调TOP2A/LDHA通路促进PCa的进展（图1-9）。基于上述证据，作者推断低剂量BDE-47诱导了TOP2A/LDHA/乳酸化正反馈回路，从而进一步促进了PCa的进展。

图10

总结：本文有很多热点研究内容，显得很新颖，另外还做了细致的实验，有力的分析了BDE-47暴露对前列腺癌发展的影响机制！傲星生物深耕生信分析十余载，有丰富的实验方案、完善的下游验证、机制研究服务，一对一专属服务为您排忧解难，助您轻松应对毕业和晋升！